b. Phương pháp cấy nấm mốc
3.2.22 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tỉnh của enzyme protease
vào độ hấp thụ của mẫu đối chúng và mẫu phân tích xác định được hoạt tính enzyme và hàm lượng protein từ đó tìm ra hoạt độ riêng cao nhất, lấy sử dụng làm nguồn enzyme cho các thí nghiệm sau.
3.2.22 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tỉnh của enzyme protease enzyme protease
- Mục đích: tìm hiểu quy luật biến đổi hoạt tính của enzyme protease ở những điều kiện môi trường khác nhau.
- Bố trí thí nghiệm Giống vi sinh vật ị Nhân giống ị Pha loãng Mật số
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 02 nhân tố.
Thí nghiệm được lặp lại 02 lần, với mỗi nghiệm thức có 01 mẫu đối chứng.
=> Tống số mẫu thí nghiệm: 6 X 5 X (2 (lần lặp lại) + 1 (mẫu đối chứng)) = 90 mẫu.
- Tiến hành thí nghiệm
Chuấn bị dung dịch enzyme từ nghiệm tối ưu ở thí nghiệm 1. Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease trên co chất là casein.
Tiến hành thí nghiệm như trên, mỗi mẫu đều tiến hành xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz (phụ lục).
3.2.2.3 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính
enzyme protease
- Mục đích: xác định động học của enzyme, tìm ra vmax và Km
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí với 01 nhân tố, 02 lần lặp lại.
Mỗi giá trị khảo sát có thực hiện thêm 01 mẫu đối chứng kèm theo. Nhân tố E: nồng độ cơ chat casein E,:0,2% E4:0,5% E7:0,8%
E2:0,3% E5:0,6% Eg: 1,0%
E3:0,4% E6:0,7% Eọ: 1,4%
Tổng số mẫu thí nghiệm: 9 X (2 (lần lặp lại) + 1 (mẫu đối chứng)) = 27 mẫu
- Tiến hành thí nghiệm:
Tiến hành thí nghiệm như trên, mỗi mẫu đều xác định hoạt tính enzyme
theo phương pháp Kunitz (phụ lục) với cơ chất casein ở các nồng độ khác nhau, điều kiện thí nghiệm với pH và nhiệt độ tối un xác định ở thí nghiệm 2.
Nhân tố C: pH n c4: 5,5 c2: 4,5 c5: 6,0 c3: 5,0 c6: 6,5 Nhân tố D: nhiệt độ D,:35°c D4: 50°c D2: 40°c D5: 55°c D3: 45°c
xác định được lượng casein bị thủy phân từ đó tìm ra vận tốc của phản ứng.
3.2.2.4 Thí nghiệm 4: khao sát khả năng thuỷ phân của enzyme protease
trên dung dịch acid protein
- Mục đích: tìm hiểu khả năng thuỷ phân của enzyme ở những thời gian thuỷ phân khác nhau.
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 01 nhân tố và 2 lần lặp lại.
Nhân to F: thời gian thuỷ phân
Fi: 10 phút F3: 30 phút F5: 50 phút F2: 20 phút F4: 40 phút F6: 60 phút
=> Tổng số mẫu thí nghiệm: 6x2 (lần lặp lại) = 12 mẫu.
- Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị dung dịch acid protein với tỉ lệ 1 : 30 (lg da cá tra : 30ml acid acetic) ngâm trong 24 giờ. Sau đó tiến hành ly tâm lấy dịch trong và bổ sung lml dung dịch enzyme protease và tiến hành thuỷ phân ở 45°c ở những thời gian khác nhau. Mầu được tiến hành như cách bố trí trên. Mầu thí nghiệm được khảo sát hàm lượng tyrosine sinh ra bằng cách đo dung dịch sau khi thuỷ phân ở bước sóng 280nm và khảo sát hàm lượng protein trước và sau khi bố sung enzyme bằng phương pháp Bradford (phụ lục).
Dựa vào độ hấp thụ của mẫu đối chứng và mẫu phân tích xác định được khả năng thuỷ phân của enzyme.