b. Phương pháp cấy nấm mốc
4.3 Kết quả khảo sát ánh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme protease
protease
Mỗi cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng. Trong thí nghiệm này ta tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính xúc tác của enzyme protease đế tìm ra thông số động học của phản ứng. Cơ chất được sử dụng ở đây là casein với các mức nồng độ khác nhau từ 0,2 1,4%. Phản ứng được tiến
hành ở nhũng điều kiện tối ưu của các thí nghiệm trên với thành phần môi trường 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin ở pH = 5 và phản ứng thuỷ phân được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 45°c, pH = 5,5.
Dung dịch sau khi lọc có chứa enzyme protease được đem xác định hoạt tính theo phương pháp Kunitz với nguồn cơ chất đã chọn. Dựa vào phương trình Michaelis - Menten tìm được thông số động học của enzyme. Động học của enzyme có liên quan mật thiết đến tốc độ của phản ứng enzyme theo thời gian, mối quan hệ giữa enzyme và nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cực đại vmax và Km.
Trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ửng sẽ gia tăng. Nhưng khi tốc độ phản ứng đạt cực đại, cho dù tăng nồng độ cơ chất thêm nữa thì tốc độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 8 và hình 27.
Các chữ cải khác nhau trong cùng một cột biếu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậv 95%.
Động học enzyme được xác định thông qua việc xử lỷ bằng chương trình SAS và kết quả enzyme protease thành phấm có vmax = l,2548pmol/phút và Km = 0,3932% và đồ thị phương trình Michaelis - Menten được thể hiện ở Báng 8: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme protease theo nồng độ casein
Nồng độ casein (%) Hoạt tính (TU/ml)
0,2 0,362d 0,3 0,550cd 0,4 0,620bcd 0,5 0,718abc 0,6 0,746abc 0,7 0,846ab 0,8 0,910a 1,0 0,908a 1,4 0,908a
Két quả thê hiện là hoạt tính của enzyme theo đon vị TU/ml, trên cơ chát là casein
hình 27.
Dựa vào kết quả ở bảng 8 cho thấy, hoạt tính enzyme protease tăng kill nồng độ cơ chat casein tăng, đường cong biểu diễn quan hệ giữa hoạt tính
Dû thi M i c h a e l i s - M e n t e n - P r o t e a s e
Vmax = 1,2548[imol/phút Km = 0,3932%
Ỵ-\—r~r-1—]—I—f—r—T“P—r~r~\—I I I ! ! I I—1—I—f—[—
r~r~1—I—I—I—! I I I
0 0 0 . 2 0 4 H 0 0 1.0 1 . 2 1 4
[ N o n g d o D a C h a t C o c a i n ] ( ỉ )
Hình 27: Ầnh hưởng của nồng độ casein lên hoạt tính enzy me protease theo phương trình
Michaelis - Menten
Qua đồ thị cho thấy hoạt tính enzyme tăng khi nồng độ cơ chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tăng cơ hội cơ chất gặp được enzyme nhiều thì tốc độ phản ứng tăng theo. Tuy nhiên sự liên hệ này chỉ giới hạn đến một nồng độ nhất định nào đó mà thôi. Theo kết quả thí nghiệm này, hoạt tính enzyme cao nhất ứng với nồng độ cơ chất là 0,8% (0,910TƯ/ml) khác biệt không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% so với nồng độ cơ chất là 1,0%. Khi tăng nồng độ cơ chất vượt quá giới hạn tối ưu thì hoạt tính enzyme gần như không tăng. Vì nồng độ casein quá cao sẽ tạo rào cản không gian gây khó khăn cho tương tác đúng giữa enzyme và cơ chất, hoặc cơ chất kết hợp không đúng cách, tạo thành phức hợp ESS không hoạt động (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, nồng độ enzyme đều tham gia phản ứng đế tạo phức hợp enzyme - cơ chất, phản ứng sẽ đạt cực đại.
Phương trình Michaelis - Menten