ENZYME PROTEASE
2.6.1 Độ ẩm môi trường
Độ ẩm của môi trường tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc là 55 ÷ 58%. Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử khoảng 45%. Cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển của nấm mốc.
2.6.2 Ảnh hưởng của không khí
Aspergillus oryzae là sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi trong môi trường có đầy đủ O2. Để đáp ứng điều kiện nuôi cấy này môi trường
phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2,5 ÷ 3,0cm, phòng nuôi cấy phải thoáng.
2.6.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH môi trường
Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme của Aspergillus oryzae là khoảng 28 ÷ 32oC. Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể lên đến 40oC hoặc cao hơn. Cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27oC và không quá 36oC.
Thích hợp cho Aspergillus oryzae phát triển là môi trường acid yếu 5,5 ÷ 6,5. Các môi trường tự nhiên từ cám, đậu, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nên không cần điều chỉnh. Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn. Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ.
2.6.4 Thời gian nuôi cấy
Hầu hết các chủng Aspergillus oryzae có hoạt động cực đại của amylase ở
giờ thứ 30 ÷ 36, rồi sau đó cực đại của protease ở giờ thứ 36 ÷ 42. Thời gian nuôi mốc giống thường hết 60 ÷ 70 giờ.
2.7 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE 2.7.1 Ứng dụng trong chế biến thực phẩm
2.7.1.1 Trong công nghiệp thịt
Trong công nghiệp thịt có sử dụng chế phẩm protease để làm mềm thịt. Ngoài papayin có thể dùng chế phẩm protease của vi sinh vật để thủy phân một phần nào đó các protein tham gia trong thành phần của thịt. Kết quả là chất lượng
của các loại thịt được tăng cao, có thể chuyển thịt loại thấp thành thịt có phẩm chất cao. Không những thế thời gian chín của thịt sẽ rút xuống nhiều lần.
2.7.1.2 Trong công nghiệp sữa
Protease không những có khả năng phân ly protein mà còn có khả năng làm
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 21
công nghiệp thực phẩm. Protease của nấm mốc và vi khuẩn cũng thể hiện khả năng đó. Tuy nhiên tất cả protease của vi sinh vật đều khác với renin của động vật ở chỗ
chúng không những làm đông tụ được sữa mà còn có thể phân hủy sâu casein, do đó
có ảnh hưởng xấu đến chất lượng phomat. Bởi vậy trong quá trình làm phomat, renin vẫn chiếm một vị trí đặc biệt trong các protease khác. Dưới tác dụng của renin, casein của sữa sẽ đông tụ thành một khối đặc không hòa tan và thu hút vào đó hầu như toàn bộ chất béo có trong sữa. Từ đây, dưới ảnh hưởng của vi khuẩn lactic
sẽ tạo thành phomat bền vững có chứa các chất dinh dưỡng quý giá hơn và có tính chất cảm quan ưu việt hơn. Hương vị của phomat sau quá trình chín có liên quan mật thiết với sự tích tụ các peptid và acid amin. Như vậy renin còn có vai trò dẫn
động trong quá trình chín của phomat nữa.
2.7.2 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác
2.7.2.1 Trong công nghiệp da
Protease của vi sinh vật cũng có tầm quan trọng trên hai quá trình: làm mềm và tách lông. Về mặt này, chế phẩm protease như là một phương tiện có hiệu quả để
hoàn thiện kĩ thuật chế biến da. Chúng ta đều biết chất quan trọng nhất của da là collagen. Phân tử của nó gồm những acid amin kết lại với nhau thành mạch dài. Dưới tác dụng của protease, các chất nhờn bị tách ra và một số liên kết trong sợi collagen bị phá hủy. Kết quả là da thu được có độ mềm nhất định và trong quá trình thuộc da tính chất này lại được củng cố thêm.
2.7.2.2 Trong sản xuất tơ tằm
Sợi thu được khi kéo ở kén ra thường có chứa 30% xerixin. Muốn tạc xerixin
thì phải nấu tơ trong dung dịch xà phòng trong thời gian từ 1,5 ÷ 2 giờ. Chỉ sau khi có sự gia công này, tơ mới bắt đầu kéo chỉ. Một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên
lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều và khó trang trí trên lụa. Để tách lượng xerixin còn lại đó người ta thường dùng chế phẩm protease từ nấm mốc và đặc biệt từ vi khuẩn.
2.7.2.3 Trong hương phẩm và mỹ phẩm
Tác dụng của protease trong kem, các biểu bì của da đã chết sẽ được tách ra, da non và mới sẽ xuất hiện trên về mặt, đồng thời sự phát triển của lông (tóc) cũng
bị chặn lại.
2.7.2.4 Trong y học
Các chế phẩm protease cũng được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Ngoài ra người ta còn dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch).
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 22
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm: phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian: từ ngày 30/01/2012 đến ngày 28/04/2012.
3.1.2 Vật liệu
Cám Trấu
Cơ chất (gelatine)
Dung dịch acid protein (da cá ngâm acid acetic trong 24 giờ)
3.1.3 Đối tượng nghiên cứu
Nấm sợi Aspergillus oryzae (chủng Aspergillus sp.) lấy từ Viện Nghiên cứu
và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ.
3.1.4 Hoá chất thí nghiệm
Gelatine (Trung Quốc)
Casein (Trung Quốc)
Acid citric 0,1M (C6H8O7.H20), (Trung Quốc)
Trinatri citrat 0,1M (C6H5O7Na3.2H20), (Trung Quốc)
Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), (Trung Quốc)
L – Cysteine hydrochlorid – monohyrate (Merck) Acid hydrochlorid 0,1N (HCl)
Trichloroacetic acid (TCA), (Trung Quốc)
L – Tyrosine (C9H11NO3), (Merck) Coomassie Brilliant Blue G – 250 Bovine Serum Albumin (BSA) Cồn 96o
Acid phosporic (H3PO4), (Trung Quốc)
Natri hydroxit (NaOH), (Trung Quốc)
Acid acetic (CH3COOH), (Trung Quốc)
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 23
3.1.5 Thiết bị thí nghiệm
Thiết bị thanh trùng
Máy đo quang phổ (Spectrophotometer)
Thiết bị ủ nhiệt (Water Bath)
Thiết bị ly tâm lạnh
Máy khuấy từ
Máy vortex
Cuvette thạch anh, Cuvette nhựa
pH kế Cân điện tử
Micropipette, pipette, nhiệt kế
Tủ lạnh và một số dụng cụ khác
Hình 11: Máy khuấy từ Hình 12: Cân điện tử
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 24
Hình 15: Tủ cấy vi sinh vật Hình 16: Thiết bị ủ nhiệt
Hình 17: Máy vortex Hình 18: Kính hiển vi điện tử
3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM3.2.1 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Phương pháp thí nghiệm
3.2.1.1 Nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae
a. Chuẩn bị môi trường PCA
- Công thức môi trường
Môi trường tự nhiên: khoai tây 20%, agar 2%, glucose 2% (thêm nước cất cho đủ 1000ml).
- Điều chế môi trường
Gọt vỏ khoai tây, cân và cắt lát mỏng cho vào nồi và thêm nước cất. Đun sôi
15 phút, chắc lấy nước cốt khoai tây cho vào bình tam giác thêm nước cất vào cho
đủ thể tích.
Cân agar và đường cho vào bình nước cốt khoai tây, đun nhẹ cho agar tan, khi đun dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều.
Sau đó khử trùng bằng nhiệt ướt ở 121oC áp suất 1atm trong thời gian 15
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 25
b. Phương pháp cấy nấm mốc
Khử trùng xong để nguội môi trường đến nhiệt độ 45oC rồi mới tiến hành đổ
vào đĩa petri (đĩa đã được hấp tiệt trùng trước), nhằm hạn chế sự ngưng tụ hơi nước trên nắp đĩa petri nhưng không để môi trường quá nguội vì làm cho thạch bị đông đặc, bề mặt môi trường không phẳng. Cần lắc nhẹ vài vòng cốc thủy tinh để đảm
bảo môi trường đồng nhất trước khi đổ đĩa. Việc đổ đĩa được thực hiện trong tủ cấy
vi sinh vật, trong không gian vô trùng của ngọn lửa đèn cồn. Tuần tự rót vào mỗi đĩa khoảng 10 ÷ 15ml môi trường, xoay tròn đĩa để môi trường trong đĩa được dàn
đều và để yên cho môi trường đặc lại. Khi môi trường đặc dùng kim cấy nấm mốc
giống Aspergillus oryzae lên trên mặt thạch và đem ủ ở 30oC trong 4 ngày.
3.2.1.2 Đếm bào tử nấm mốc
Đếm bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu.
Cách tính mật số bào tử nấm mốc N = a k 016 , 0 103
Trong đó a: số tế bào đếm được
N: mật số bào tử nấm số (CFU/ml)
k: hệ số pha loãng
103: hệ số quy đổi ml sang µl
3.2.2 Bố trí thí nghiệm
3.2.2.1 Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease
- Mục đích: nuôi Aspergillus oryzae ở các thành phần môi trường và pH môi
trường khác nhau. Từ đó xác định thành phần môi trường và pH môi trường thích
hợp để nấm sợi sinh tổng hợp enzyme protease mạnh nhất. - Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với 02 nhân tố hoàn toàn ngẫu nhiên với 02 lần
lặp lại.
Nhân tố A: thành phần môi trường
A1: 75% cám + 15% trấu + 10% cơ chất A2: 75% cám + 20% trấu + 5% cơ chất A3: 70% cám + 25% trấu + 5% cơ chất
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 26
Nhân tố B: pH môi trường
B1: pH = 3 B2: pH = 4
B3: pH = 5 B4: pH = 6
Tổng số mẫu thí nghiệm: 3 x 4 x 2 (lần lặp lại) = 24 mẫu
- Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho mỗi mẫu là 30g. Các mẫu được tiến hành như cách bố trí trên. Mẫu thí nghiệm được khảo sát hoạt tính của enzyme bằng phương pháp Kunitz (phụ lục) với cơ chất casein. Điều kiện thí nghiệm: cố định mật
số nấm mốc 5x106CFU/ml, nhiệt độ 30oC, độ ẩm 60%, thời gian nuôi cấy 42 giờ và khảo sát hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (phụ lục).
Hình 19: Quy trình thí nghiệm sản xuất enzyme protease
Dựa vào độ hấp thụ của mẫu đối chứng và mẫu phân tích xác định được
hoạt tính enzyme và hàm lượng protein từ đó tìm ra hoạt độ riêng cao nhất, lấy sử
dụng làm nguồn enzyme cho các thí nghiệm sau.
3.2.2.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease enzyme protease
- Mục đích: tìm hiểu quy luật biến đổi hoạt tính của enzyme protease ở
những điều kiện môi trường khác nhau.
- Bố trí thí nghiệm Nguyên liệu (30g) Trộn, làm ẩm (chỉnh pH (B)) Thanh trùng (121oC, 15 phút) Làm nguội Ủ 30oC, 42 giờ Trộn giống VSV
Thu nhận chế phẩm enzyme thô
Đo hoạt tính enzyme
Giống vi sinh vật
Nhân giống
Pha loãng Mật số 5x106CFU/ml
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 27
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 02 nhân tố.
Nhân tố C: pH C1: 4,0 C2: 4,5 C3: 5,0 C4: 5,5 C5: 6,0 C6: 6,5 Nhân tố D: nhiệt độ D1: 35oC D4: 50oC D2: 40oC D5: 55oC D3: 45oC
Thí nghiệm được lặp lại 02 lần, với mỗi nghiệm thức có 01 mẫu đối
chứng.
Tổng số mẫu thí nghiệm: 6 x 5 x (2 (lần lặp lại) + 1 (mẫu đối
chứng)) = 90 mẫu.
- Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị dung dịch enzyme từ nghiệm tối ưu ở thí nghiệm 1.
Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease trên cơ chất là casein.
Tiến hành thí nghiệm như trên, mỗi mẫu đều tiến hành xác định hoạt
tính enzyme bằng phương pháp Kunitz (phụ lục).
3.2.2.3 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme protease protease
- Mục đích: xác định động học của enzyme, tìm ra Vmax và Km - Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí với 01 nhân tố, 02 lần lặp lại.
Mỗi giá trị khảo sát có thực hiện thêm 01 mẫu đối chứng kèm theo. Nhân tố E: nồng độ cơ chất casein
E1: 0,2% E2: 0,3% E3: 0,4% E4: 0,5% E5: 0,6% E6: 0,7% E7: 0,8% E8: 1,0% E9: 1,4%
Tổng số mẫu thí nghiệm: 9 x (2 (lần lặp lại) + 1 (mẫu đối chứng)) = 27 mẫu
- Tiến hành thí nghiệm:
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 28
theo phương pháp Kunitz (phụ lục) với cơ chất casein ở các nồng độ khác nhau, điều kiện thí nghiệm với pH và nhiệt độ tối ưu xác định ở thí nghiệm 2.
Dựa vào độ hấp thụ của mẫu đối chứng và mẫu phân tích ta có thể xác định được lượng casein bị thủy phân từ đó tìm ra vận tốc của phản ứng.
3.2.2.4 Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng thuỷ phân của enzyme protease trên dung dịch acid protein dung dịch acid protein
- Mục đích: tìm hiểu khả năng thuỷ phân của enzyme ở những thời gian thuỷ
phân khác nhau.
- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 01 nhân
tố và 2 lần lặp lại.
Nhân tố F: thời gian thuỷ phân
F1: 10 phút F2: 20 phút F3: 30 phút F4: 40 phút F5: 50 phút F6: 60 phút Tổng số mẫu thí nghiệm: 6 x 2 (lần lặp lại) = 12 mẫu.
- Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị dung dịch acid protein với tỉ lệ 1 : 30 (1g da cá tra : 30ml acid acetic) ngâm trong 24 giờ. Sau đó tiến hành ly tâm lấy dịch trong và bổ sung 1ml
dung dịch enzyme protease và tiến hành thuỷ phân ở 45oC ở những thời gian khác
nhau. Mẫu được tiến hành như cách bố trí trên. Mẫu thí nghiệm được khảo sát hàm
lượng tyrosine sinh ra bằng cách đo dung dịch sau khi thuỷ phân ở bước sóng
280nm và khảo sát hàm lượng protein trước và sau khi bổ sung enzyme bằng phương pháp Bradford (phụ lục).
Dựa vào độ hấp thụ của mẫu đối chứng và mẫu phân tích xác định được khả năng thuỷ phân của enzyme.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 29
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và pH môi trường
khácnhau đến quá trình sinh tổng hợp enzyme protease
Thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh tổng
hợp enzyme. Thành phần chính của môi trường nuôi cấy nấm mốc tạo enzyme
protease bằng phương pháp bề mặt là cám gạo. Cám là nguyên liệu hoàn hảo có thể
sử dụng làm thành phần của môi trường để nuôi cấy vi sinh vật tạo enzyme. Tuy nhiên, sử dụng cám làm nguyên liệu chính nhưng cần cho thêm 20 ÷ 25% trấu vào
môi trường để tạo độ xốp và tạo nên những khoảng trống để không khí lưu thông
bên trong môi trường một cách dễ dàng (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Nguồn cơ chất
cảm ứng cũng có ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Nếu cơ
chất thích hợp sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme có
hoạt tính cao nhất.
Hình 20: Môi trường sau khi ủ 42 giờ Hình 21: Dịch lọc thô enzyme protease
Giá trị pH ban đầu của môi trường nuôi cấy là một trong những nhân tố có ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Mỗi loại vi sinh vật và enzyme khác nhau cần có giá trị pH tối ưu riêng cho hoạt động sinh tổng hợp đạt được hiệu quả cao nhất. Dung dịch đệm citrate được sử dụng để pha loãng nhằm điều chỉnh pH của môi trường về các mức pH cần khảo sát (3, 4, 5, 6), độ ẩm môi trường 60%, thanh trùng môi trường, cấy nấm mốc và ủ trong 42 giờ. Kết quả thống
kê ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy và pH ban đầu đối với sự thay đổi hoạt tính tổng enzyme protease và hoạt tính riêng của enzyme protease được thể
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 30