Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch in vitro với kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT-6, CFP-10, TB7.7 ở bệnh nhân lao phổi và người nhà tiếp xúc tại tỉnh Bình Định

ĐẶT VẤN ĐỀ Hằng năm có khoảng 9 triệu người bị mắc bệnh lao và 1/3 dân số thế giới, khoảng 2 tỷ người có nguy cơ nhiễm lao, trong số đó đáng quan tâm là tình hình nhiễm lao tiềm ẩn (latent tuberculosis infection, LTA), mặc dù người nhiễm lao tiềm ẩn không có biểu hiện lâm sàng và không lây nhiễm nhưng có nguy cơ phát triển thể lao hoạt động và lây nhiễm, hằng năm có khoảng 2 triệu người tử vong do bệnh lao, việc điều trị LTA sẽ giúp khống chế sự tiến triển sang thể lao hoạt động. Hiện nay test da tuberculin vẫn được xem là xét nghiệm miễn dịch có giá trị trong chẩn đoán bệnh lao hoạt động, tuy nhiên test tuberculin có một số hạn chế về độ nhạy cũng như độ đặc hiệu. Đối với người đã chủng vắc xin BCG thì kết quả vẫn dương tính, hơn nữa test đòi hỏi bệnh nhân phải trở lại để đọc kết quả do đó một số người đã không quay trở lại. Ngoài ra, đáp ứng miễn dịch tế bào chống vi khuẩn lao không những đáp ứng đối với protein cấu trúc vi khuẩn mà còn là đối với các protein tiết trong quá trình vi khuẩn ký sinh trong đại thực bào. Do đó trong nhiều năm trở lại đây, người ta đã nghiên cứu thử nghiệm in vitro gồm các kỹ thuật đánh giá các cytokin (IFN-γ, TNF-α, IL12) do các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch chống lao sản xuất như tế bào đơn nhân/đại thực bào, tế bào lympho T, tế bào lympho B tiết ra. Những nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch đối với các protein tiết mở ra một hướng mới về việc sản xuất một vắc xin chống vi khuẩn lao đặc hiệu và có hiệu quả bảo vệ cao hơn BCG. Ở Trung Quốc, người ta đã thử nghiệm test da trên chuột với kháng nguyên tiết ESAT-6 và theo dõi đáp ứng miễn dịch tế bào qua việc định lượng IFN-γ ở môi trường nuôi cấy tế bào đơn nhân/đại thực bào và tế bào lympho T. Trong bệnh lao, đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào do các tế bào lympho T và đại thực bào thực hiện thông qua các cytokin. Khi cơ thể tiếp xúc với vi khuẩn lao lần đầu tiên thì sẽ sản xuất các tế bào lympho T mẫn cảm (tế bào lympho TCD4 + và TCD8 + ). Khi vi khuẩn lao xâm nhập những lần sau thì các tế bào này sẽ phản ứng lại và tiết nhiều cytokin hòa tan, đặc biệt là IFN-γ. Đo nồng độ IFN- γ được sản xuất từ nuôi cấy tế bào đơn nhân ngoại vi khi được kích thích bởi kháng nguyên đặc hiệu của Mycobacterium tuberculosis (MT) có thể đánh giá đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào của từng cá thể, kỹ thuật này như đã mở ra một khía cạnh mới trong lĩnh vực miễn dịch học chẩn đoán bệnh lao. Nghiên cứu sử dụng bộ hóa chất QuantiFeron-TB Gold in tube (QFTGIT) đo lượng IFN-γ được tiết ra từ các tế bào đơn nhân máu ngoại vi bị kích hoạt bởi kháng nguyên đặc hiệu MT là ESAT-6, CFP-10, TB7.7, gọi là kỹ thuật IGRA (interferon gamma releasing assay). Phân tích, so sánh để tìm mối tương quan giữa đáp ứng miễn dịch nói trên và các dữ liệu lâm sàng, X-quang phổi, chỉ số AFB xét nghiệm đàm … ở người tiếp xúc trong gia đình bệnh nhân lao, nhằm xác định người nhiễm lao có nguy cơ phát triển thành bệnh lao, đồng nghĩa với chẩn đoán sớm bệnh lao, và đây cũng là một mục tiêu chính trong chương trình phòng chống lao quốc gia. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch in vitro với kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT-6, CFP-10, TB7.7 ở bệnh nhân lao phổi và người nhà tiếp xúc tại tỉnh Bình Định”. Mục tiêu của đề tài như sau: 1. Xác định tỉ lệ dương tính và nồng độ IFN- γ sản xuất từ các tế bào đơn nhân máu ngoại vi sau khi kích hoạt bởi kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao là ESAT-6, CFP-10, TB 7.7 ở nhóm người lao phổi AFB (+) và người nhà tiếp xúc. 2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của thử nghiệm trên trong chẩn đoán bệnh lao, mô tả sự liên quan giữa nồng độ IFN- γ với một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng.

VÀ NGƯỜI NHÀ TIẾP XÚC TẠI TỈNH BÌNH ĐỊNH

LUẬN ÁN CHUYÊN KHOA CẤP II

HUẾ – 2012

VÀ NGƯỜI NHÀ TIẾP XÚC TẠI TỈNH BÌNH ĐỊNH

Chuyên ngành: Nội Khoa

Mã số: CK 62 72 20 40

LUẬN ÁN CHUYÊN KHOA CẤP II

Người hướng dẫn khoa học:

Hướng dẫn 1: PGS.TS.TRẦN THỊ MINH DIỄM Hướng dẫn 2: TS HOÀNG VIẾT THẮNG

HUẾ – 201

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hằng năm có khoảng 9 triệu người bị mắc bệnh lao và 1/3 dân số thế giới, khoảng 2 tỷ người có nguy cơ nhiễm lao, trong số đó đáng quan tâm là tình hình nhiễm lao tiềm ẩn (latent tuberculosis infection, LTA), mặc dù người nhiễm lao tiềm ẩn không có biểu hiện lâm sàng và không lây nhiễm nhưng có nguy cơ phát triển thể lao hoạt động và lây nhiễm, hằng năm có khoảng 2 triệu người tử vong do bệnh lao, việc điều trị LTA sẽ giúp khống chế sự tiến triển sang thể lao hoạt động

Hiện nay test da tuberculin vẫn được xem là xét nghiệm miễn dịch có giá trị trong chẩn đoán bệnh lao hoạt động, tuy nhiên test tuberculin có một số hạn chế về độ nhạy cũng như độ đặc hiệu Đối với người đã chủng vắc xin BCG thì kết quả vẫn dương tính, hơn nữa test đòi hỏi bệnh nhân phải trở lại để đọc kết quả do đó một số người đã không quay trở lại Ngoài ra, đáp ứng miễn dịch tế bào chống vi khuẩn lao không những đáp ứng đối với protein cấu trúc

vi khuẩn mà còn là đối với các protein tiết trong quá trình vi khuẩn ký sinh trong đại thực bào Do đó trong nhiều năm trở lại đây, người ta đã nghiên cứu thử nghiệm in vitro gồm các kỹ thuật đánh giá các cytokin (IFN-γ, TNF-α, IL-12) do các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch chống lao sản xuất như tế bào đơn nhân/đại thực bào, tế bào lympho T, tế bào lympho B tiết ra

Những nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch đối với các protein tiết mở ra một hướng mới về việc sản xuất một vắc xin chống vi khuẩn lao đặc hiệu và

có hiệu quả bảo vệ cao hơn BCG Ở Trung Quốc, người ta đã thử nghiệm test

da trên chuột với kháng nguyên tiết ESAT-6 và theo dõi đáp ứng miễn dịch tế bào qua việc định lượng IFN-γ ở môi trường nuôi cấy tế bào đơn nhân/đại thực bào và tế bào lympho T

Trong bệnh lao, đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào do các tế bào lympho T và đại thực bào thực hiện thông qua các cytokin Khi cơ thể tiếp xúc với vi khuẩn lao lần đầu tiên thì sẽ sản xuất các tế bào lympho T mẫn cảm (tế

bào lympho TCD4+ và TCD8+) Khi vi khuẩn lao xâm nhập những lần sau thì các tế bào này sẽ phản ứng lại và tiết nhiều cytokin hòa tan, đặc biệt là IFN-γ

Đo nồng độ IFN- γ được sản xuất từ nuôi cấy tế bào đơn nhân ngoại vi khi

được kích thích bởi kháng nguyên đặc hiệu của Mycobacterium tuberculosis

(MT) có thể đánh giá đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào của từng cá thể, kỹ

thuật này như đã mở ra một khía cạnh mới trong lĩnh vực miễn dịch học chẩn đoán bệnh lao

Nghiên cứu sử dụng bộ hóa chất QuantiFeron-TB Gold in tube GIT) đo lượng IFN-γ được tiết ra từ các tế bào đơn nhân máu ngoại vi bị kích

(QFT-hoạt bởi kháng nguyên đặc hiệu MT là ESAT-6, CFP-10, TB7.7, gọi là kỹ

thuật IGRA (interferon gamma releasing assay) Phân tích, so sánh để tìm mối tương quan giữa đáp ứng miễn dịch nói trên và các dữ liệu lâm sàng, X-quang phổi, chỉ số AFB xét nghiệm đàm … ở người tiếp xúc trong gia đình bệnh nhân lao, nhằm xác định người nhiễm lao có nguy cơ phát triển thành bệnh lao, đồng nghĩa với chẩn đoán sớm bệnh lao, và đây cũng là một mục tiêu chính trong chương trình phòng chống lao quốc gia Do đó chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch in vitro với kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT-6, CFP-10, TB7.7 ở bệnh nhân lao phổi và người nhà tiếp xúc tại tỉnh Bình Định” Mục tiêu của đề tài như sau:

1 Xác định tỉ lệ dương tính và nồng độ IFN- γ sản xuất từ các tế bào đơn nhân máu ngoại vi sau khi kích hoạt bởi kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao là ESAT-6, CFP-10, TB 7.7 ở nhóm người lao phổi AFB (+) và người nhà tiếp xúc

2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của thử nghiệm trên trong chẩn đoán bệnh lao, mô tả sự liên quan giữa nồng độ IFN- γ với một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ KHÁI NIỆM, ĐỊNH NGHĨA VÀ CÁC CHỈ SỐ DỊCH TỄ HỌC BỆNH LAO

1.1.1 Nhiễm lao

1.1.1.1 Tỉ lệ nhiễm lao

Là tỉ lệ số người nhiễm lao (người có phản ứng tuberculin dương tính) trong một quần thể tại một thời điểm nhất định

Tỉ lệ nhiễm lao cho thấy mức độ nhiễm lao trong cộng đồng

1.1.1.2 Nguy cơ nhiễm lao hàng năm (Annual rick of tuberculous infection ARTI):

Là khả năng một người lành có thể bị nhiễm hoặc tái nhiễm lao trong khoảng thời gian một năm

Nguy cơ nhiễm lao hàng năm đánh giá gián tiếp tình hình bệnh lao và xu hướng dịch tễ của bệnh lao

1.1.2 Tỷ lệ mắc lao

1.1.2.1 Tỉ lệ hiện mắc (prevalence rate)

Tỉ lệ người hiện mắc lao trong quần thể dân số nhất định tại khoảng thời gian hoặc thời điểm xác định

Tỉ lệ hiện mắc cho thấy mức độ trầm trọng của dịch bệnh về số nguồn lây đang lưu hành, xu hướng dịch tễ, và hiệu quả của chương trình chống lao

1.1.2.2 Tỉ lệ mắc mới hàng năm (incidence rate)

Tỉ lệ người mới mắc bệnh lao trong quần thể nhất định trong khoảng thời

gian một năm

Tỉ lệ mới mắc cho phép đánh giá tác động của các yếu tố nguy cơ của bệnh lao và là căn cứ hoạch định chính sách can thiệp để làm giảm các nguy cơ

đó trong một quần thể [6]

1.2 SINH BỆNH HỌC CỦA BỆNH LAO

1.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể xuất hiện tại tổn thương trong những ngày đầu nhiễm lao nhằm tiêu diệt VK Nếu đáp ứng tốt, số lượng

VK ít, VK lao có thể bị tiêu diệt ngay Thành phần miễn dịch không đặc hiệu được biết gồm có: bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào phế nang, tế bào T-γ/δ, T-α/β, protein của đại thực bào liên quan đến tính kháng tự nhiên (Nramp) và một số tế bào khác [10], [32]

1.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

Miễn dịch đặc hiệu hay miễn dịch thích nghi khởi phát khi kháng nguyên vi khuẩn lao được đại thực bào trình diện cho các lympho T với sự

dưới 5% trường hợp có hệ miễn dịch không kiểm soát được nhiễm khuẩn nên VK lao có thể phát triển lan tràn (theo đường máu và bạch huyết) gây bệnh ở nhiều tạng trong cơ thể (lao kê, lao nhiều tạng, v.v.) Phần lớn các trường hợp (90%) sau nhiễm khuẩn không bị bệnh, trong đó có những cơ thể bị nhiễm lao tiềm tàng Trong số này chỉ 5%-10% trường hợp chuyển thành bệnh lao (khi chưa có đại dịch HIV/ AIDS) [10], [32]

Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể đối với bệnh lao được thực hiện theo hai phương thức: đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và đáp ứng miễn dịch dịch thể

Ngày nay, nhiều công trình nghiên cứu sâu hơn cũng đã làm sáng tỏ vai trò của đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào trong đáp ứng miễn dịch bệnh lao Kiểu đáp ứng này giúp cơ thể khống chế loại trừ VK lao thông qua hoạt hoá đại thực bào

Đại thực bào tiêu diệt VK lao, các kháng nguyên của VK lao được giải phóng, trong đó có kháng nguyên LAM (lipopolyarbinomanose) Kháng nguyên LAM kích thích đại thực bào tiết ra các cytokin TNF-α, IL-1, -6, -8 và protein vận mạch có tác dụng kích thích quá trình chuyển tế bào đơn nhân thành tế bào dạng biểu mô và tế bào khổng lồ Langhans, tại tổn thương hình thành nên u hạt, giới hạn sự lan tràn của VK lao [1], [82]

Miễn dịch qua trung gian tế bào được phân lớp tế bào lympho T thực hiện, chúng tuần hoàn trong máu và hạch bạch huyết, có thể di chuyển qua các khoảng trống giữa các tế bào Mỗi kiểu đáp ứng miễn dịch được kiểm soát bởi các dòng lympho khác nhau Các nhóm lympho T thực hiện ba chức năng chính: hỗ trợ (Th), ức chế (Ts) hoặc gây độc (Tc) Tế bào T hỗ trợ, chủ yếu là

kích thích đáp ứng miễn dịch của tế bào khác Nhóm tế bào T gây độc, chủ

nhận biết và tiêu diệt những tế bào đã bị nhiễm và hoạt hoá tế bào thực bào tiêu diệt tác nhân gây bệnh [1], [20],[82]

Miễn dịch tế bào đóng vai trò quyết định trong đáp ứng miễn dịch bảo

vệ cơ thể chống lại VK lao, các loại tế bào tham gia vào quá trình miễn dịch rất phong phú [27], [54], điển hình là một số loại sau:

- Quần thể tế bào lympho T:

Dựa trên cấu trúc thụ thể bề mặt của tế bào lympho T, quần thể tế bào

năng chính là sản xuất ra các cytokin để hoạt hoá đại thực bào và diệt các đại thực bào kém hoạt hoá chứa VK lao Sự thay đổi các đặc điểm chức năng của

tế bào lympho T trước và sau điều trị đã đưa ra giả thiết về dấu ấn miễn dịch mới của tình trạng lao lâm sàng và khối lượng lớn kháng nguyên VK lao, đây cũng là vấn đề cần được đánh giá ở những nghiên cứu rộng hơn trong tương lai [82]

* Tế bào lympho T CD1: một số tác giả cho rằng T-CD1 nhận dạng kháng nguyên lipid và hoạt hoá tiêu diệt các đại thực bào chứa VK lao

kháng nguyên ngoại bào từ phân tử MHC lớp II, tiết ra IFN-γ và các cytokin khác hoạt hoá đại thực bào để thực bào VK lao, khởi xướng đáp ứng miễn dịch

tế bào Đại thực bào thiếu thụ thể của CD4 sẽ giảm khả năng di chuyển, giảm khả năng tiết TNF-α, giảm khả năng hoá hướng động đối với MCP-1 và giảm khả năng gắn với tế bào biểu mô mạch

tạo điều kiện cho các đại thực bào khác thực bào [3], [10], [82]

* Tế bào lympho T-γ/δ: vai trò của các tế bào lympho T γ/δ trong đáp ứng miễn dịch ở bệnh lao cũng chưa được biết hết Tế bào lympho T-γ/δ là tế bào có nhân to, có thể phát triển thành tế bào đuôi gai trong hệ bạch huyết

độc [3], [82] Tế bào T-γ/δ có vai trò trong đáp ứng miễn dịch sớm, và trong lao tiềm tàng

Th1 và Th2 là 2 phân týp của tế bào lympho T CD4, do tế bào T CD4

IFN-γ, có vai trò trong đáp ứng miễn dịch bảo vệ nhiễm khuẩn nội bào, Tế bào

- Vai trò của các Interleukin(IL):

Vai trò đáp ứng miễn dịch trong lao phụ thuộc các tế bào miễn dịch thông qua cytokin Việc giảm tổng hợp cytokin có liên quan đến tình trạng dinh dưỡng của bệnh nhân lao, ví dụ như các vi chất ở nồng độ thấp [3],[32]

* IL-1: IL-1 gồm IL-1 (α) và IL-1 (β) do đại thực bào tiết ra Cùng với TNF- α, IL-1 có vai trò đáp ứng trong giai đoạn cấp của bệnh như gây sốt, suy kiệt, tạo điều kiện bộc lộ thụ thể của IL-2 và giải phóng IL-2, tham gia hình thành u hạt

* IL-2: là cytokin đa chức năng do tế bào lympho Th dạng hoạt tính

hoạt hoá đại thực bào [3], [10], [82] Chức năng ban đầu của IL-2 là hỗ trợ phát triển tế bào T đặc hiệu kháng nguyên và tạo trí nhớ định hình Ngoài ra, IL-2 có khả năng tác động đến tế bào giết tự nhiên (NK), tế bào B và chức năng thực bào Như vậy, IL-2 gia tăng hoạt tính diệt khuẩn của đại thực bào, tăng khả năng tạo cytokin và bộc lộ thụ thể của cytokin trên bề mặt tế bào Trong thực tế, IL-2 cần thiết cho quá trình phòng vệ của cơ thể chống nhiễm khuẩn tế bào Mặc dù, IL-2 kích thích chức năng miễn dịch tế bào nhưng không đặc hiệu riêng biệt cho kiểu đáp ứng týp 1 Tế bào T tiết IL-2 và tế bào

tiết IFN- ở giai đoạn khởi đầu và trình diện, nhưng chỉ tác động tiết IL-4 trong giai đoạn khởi đầu Tóm lại, IL-2 đóng vai trò trung tâm trong quá trình

miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể, tạo ra đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao do khởi động một “kho chứa” tế bào lympho T đặc hiệu

* IL-4: do Th2 tiết ra, làm giảm đáp ứng của Th1, nhưng không tăng

* IL-6: do tế bào lympho B tiết ra, tham gia giảm phản ứng viêm, tạo máu, biệt hoá tế bào lympho T, ngăn chặn đáp ứng của tế bào lympho T [3], [32]

* IL-8: do tế bào đơn nhân, đại thực bào, tế bào biểu mô phế quản, tế bào xơ và cả tế bào lympho T tiết ra, có vai trò liên kết tổ chức tạo thành hang lao, làm cho tổn thương ổn định, hoá hướng động quan trọng, có khả năng chiêu mộ bạch cầu đa nhân, tế bào lympho và bạch cầu ưa bazơ

* IL-10: có tác dụng chống viêm, được tiết từ đại thực bào và tế bào

IL-10 trực tiếp ức chế đáp ứng của TCD4 và chức năng của tế bào trình diện kháng nguyên (APC)

* IL-12: do đại thực bào và tế bào đuôi gai tiết ra IL-12 kích thích

T-CD4 biệt hoá thành Th1

* Interferon- gamma (IFN- ): có vai trò quan trọng trong đáp ứng

phát triển của VK lao [1], [10], [32], [82]

* Yếu tố gây hoại tử u (Tumour Necrosis Factor-alpha: TNFα):

TNF-α chủ yếu do đại thực bào tiết ra, ngoài ra TNF-α cũng được tổng hợp bởi tế bào đuôi gai và lympho khác

TNF-α có một số chức năng: phối hợp với IFN-  kích thích đại thực

hoạt động của thụ thể tế bào; tăng kết dính VK lao vào thụ thể bề mặt đại thực bào; là yếu tố chính gây hoại tử tế bào ở phổi, hình thành bã đậu tại tổn thương trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể, TNF-α còn có vai trò quan trọng hơn ở vách tổn thương, ngăn chặn sự phát triển của VK lao và góp phần hình thành u hạt Tình trạng sốt kéo dài và sút cân trong bệnh lao là do đại thực bào tiết TNF-α dai dẳng Theo Algood Holly M.Scott (2005), nhận xét TNF-α có vai trò chủ yếu trong kiến tạo cấu trúc, duy trì tính ổn định bền vững của u hạt, qua đó sẽ cố định vị trí nhiễm khuẩn, ngăn ngừa phát sinh miễn dịch bệnh lý [1], [10], [32], [82]

Số liệu lâm sàng và thực nghiệm cho thấy TNF-α có hiệu quả khác nhau tại các thời điểm nhiễm VK lao khác nhau, liên quan đến miễn dịch bệnh

lý và phòng vệ Trong thời kỳ đầu nhiễm khuẩn, TNF-α thúc đẩy VK lao vượt qua ngưỡng tế bào biểu mô phổi và gây nhiễm, do VK lao cảm ứng tế bào biểu

mô phổi tiết TNF-α, gây ức chế khả năng bảo vệ của tế bào biểu mô phổi Khi hình thành đáp ứng viêm, TNF-α thúc đẩy huỷ hoại tế bào ở phổi và các vùng khác qua cơ chế chết theo chương trình (apoptosis) TNF-α có khả năng kiểm soát nhiễm VK lao [3], [8],[10], [31]

A Đại thực bào tiếp nhận TNF-α: chiêu mộ các tế bào

B LymphoT tiếp nhận TNF-α từ các đại thực bào: tăng cường diệt VK

C Đại thực bào và lymphoT tiếp nhận TNF-

(tự chết của lymphoT)

D Điều trị thuốc kháng TNF-α: tổ chức hạt bị phá hủy, VK lan tràn

Hình 1.1 Vai trò của TNF-α trong nhiễm trùng lao (S Ehles, 2005)

* TGF-β (Transforming Growth Factor-β): TGF-β tồn tại trong u hạt,

do tế bào đơn nhân tiết ra TGF- β hỗ trợ chống viêm, do có khả năng ức chế

(β) TGF-β có thể là yếu tố tham gia ức chế đáp ứng miễn dịch của cơ thể [1], [8], [10], [32]

*Miễn dịch dịch thể:

Miễn dịch dịch thể có vai trò thứ yếu trong hệ thống miễn dịch bảo vệ

cơ thể chống lại VK lao Kháng thể dịch thể không trực tiếp tiêu diệt được VK lao, nhưng có tính độc với VK lao, thúc đẩy quá trình thực bào

Trong mối tương tác giữa VK và tế bào, bên cạnh quần thể lympho T còn có sự tham gia của tế bào lympho B thông qua tế bào Th và từ đó sản sinh

ra globulin miễn dịch gồm: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE [8], [10], [32]

1.2.3 Vi khuẩn lao đề kháng với hệ miễn dịch của cơ thể

- VK lao ức chế sự kiểm soát của 2 phân tử MHC lớp I và lớp II trong

bào này (kéo dài 6 - 12 tháng kể từ khi bắt đầu điều trị lao)

- VK lao hạn chế hiện tượng thực bào của đại thực bào, do chúng chiếm thụ thể bổ thể CR3, CR4 của đại thực bào [1], [8], [10], [82]

- Khi ở trong phagosome của đại thực bào, VK lao ngăn cản sự hòa màng của các túi a-xít, ngăn cản hoạt động của bơm proton ATP-ases, tăng pH trong phagosomes lên 6,3 - 6,5 (bình thường 4,5), VK lao khó bị tiêu diệt

- VK lao “bắt” đại thực bào sản xuất quá mức các cytokin có tác dụng

ức chế lympho T (IL-10, IL-1, IL-12, IL-15, v.v.) làm giảm chức năng tế bào

T và ức chế các cytokin tiền viêm

Vi khuẩn lao bị kết dính với đại thực bào nhờ các tuy thể CR3, TLRs…

Sơ đồ 1.1.Trình diện kháng nguyên của đại thực bào và quá trình khởi động

đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể trong bệnh lao [8], [32]

-U hạt: Tế bào TCD4+ chiếm chủ yếu ở lớp bao quanh u hạt và kể cá tế

tế bào dạng biểu mô Hiện tượng apoptosis chủ yếu ở tế bào dạng biểu mô Tăng sinh vi khuẩn xảy ra tại chổ có cả tế bào xuất xứ từ đại thực bào và tế bào lympho Sự dính tế bào của các dòng tế bào tại u hạt thực hiện qua trung gian của các yếu tố dính, ít nhất bởi yếu tố ICAM-1, một phân tử bề mặt được gia tăng bởi vi khuẩn hoặc LAM [83] Các tế bào dạng biểu mô biệt hóa sản xuất

các protein nền ngoại bào (osteopontin, fibronectin), hoạt động như cộng sự neo tế bào 13ien13 qua các intergrin [1], [10], [32]

Sinh thiết hạch lympho cho thấy có 4 loại dựa trên cấu trúc của u hạt, loại và số lượng tế bào, tính chất của hoại tử: (1) quá sản (22,4%) u hạt tế bào dạng biểu mô và ít hoại tử, (2) u hạt gồm tế bào dạng biểu mô, đại thực bào, tế bào lympho và tương bào với hoại tử bả đậu ái toan, (3) giảm hoạt tính (17,7%) u hạt tổ chức kém với đại thực bào, tế bào dạng biểu mô chưa chin, tế bào lympho và tương bào, chủ yếu hoại tử bả đậu ái kiềm, (4) không hoạt động (3,6%) u hạt không tổ chức tốt với đại thực bào, tế bào lympho, tương bào và bạch cầu nhân đa dạng không có hoại tử bả đậu [1], [32], [82]

- Chemokin: sự tương tác giữa đại thực bào với các tế bào hiệu ứng khác

xảy ra ở giữa các 13ien13ine và chemokin Các phân tử này sử dụng tập trung

tế bào viêm cũng như các tế bào lympho và hoạt hóa chúng

- Interleukin -8: Tập trung thu hút BCTT, tế bào T, và ái kiềm để đối

phó với các kích thích Được tiết chủ yếu bởi tế bào xơ non, tế bào lympho, tế bào sừng IL-8 là chất hoạt hóa BCTT [1], [10], [32]

Nồng độ IL-8 tăng trong dịch rửa tiểu phế quản hoặc dịch nuôi cấy tế bào lympho, biểu lộ gen cũng tăng so với nhóm chứng [82]

- Các chemokin khác: các chemokin khác liên quan đáp ứng miễn dịch

đối với vi khuẩn lao như MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), RANTES (regulation on activation normal T cell expressed and secreted), cả hai giảm trong pha hồi phục sau khi điều trị, đối kháng với IL-8 Thực nghiệm trên chuột in vivo và in vitro, chứng minh vi khuẩn lao gây sản xuất một loạt chemokin như RANTES, MIP-α (macrophage IFNlammatory protein –α), MIP-2, MCP-1, MCP-3, MCP-5, và IP10 [32], [82] Thụ thể 2 của chemokin C-C (CCR2) là thụ thể đối với MCP-1, 3, 5 và hiện diện trên đại thực bào và tế bào T hoạt hóa Chuột không có CCR2-/- cực kỳ nhạy cảm với vi khuẩn lao và

thiếu hụt sự tập trung đại thực bào tại phổi Các tài liệu gần đây chứng minh TNF-α có thể điều biến tăng biểu lộ MIP-α, MIP1-β, MIP1, MIP2, CINC (cytokine –induced neutrophil chemoattractant) và RANTES, và nó có thể ảnh hưởng sự tập trung của BCTT, tế bào lympho, và tế bào đơn nhân/đại thực bào [1], [10], [32], [82]

RANTES, MCP-1, MIP1-α, và MIP-β tăng sau nhiễm vi khuẩn in vitro

ở các đại thực bào phế nang Ở người CCR5, thụ thể của RANTES, MIP1-α,

và MIP-β tăng trên đại thực bào phế nang ở bệnh nhân lao phổi [3], [10], [82]

1.3 CƠ CHẾ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN 1.3.1 Kháng nguyên ESAT-6 (Early Secretory Antigenic Target 6 KDa), CFP-10 (Culture Filtrate Protein 10) và TB 7.7

Lao là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi vi khuẩn M tuberculosis,

thường lây lan cho vật chủ mới qua trung gian các giọt bắn phần tử mang mầm bệnh trong không khí từ bệnh nhân lao phổi (khạc ra vi khuẩn) Một cá nhân mới bị nhiễm bệnh có thể phát triển thành bệnh lao trong vòng vài tuần, vài tháng hoặc lâu hơn, nhưng đa số người nhiễm bệnh vẫn chưa hoặc không biểu hiện triệu chứng Phản ứng Tuberculin thường biểu hiện dương tính ít nhất sau

2 đến 10 tuần sau khi nhiễm vi khuẩn lao hoặc sau chủng BCG Tuy nhiên, một số cá thể, bao gồm cả những người có đề kháng hoặc không đề kháng miễn dịch với Tuberculin có thể cho kết quả âm tính Ngược lại, một số cá thể không nhiễm lao hoặc nhiễm Mycobacterium khác vẫn cho kết quả dương tính với Tuberculin [45], [73]

Nhiễm lao (hay bệnh lao tiềm ẩn) phải được phân biệt với mắc bệnh lao thật sự Mục đích chính của chẩn đoán nhiễm lao là để chẩn đoán sớm và xem xét điều trị phòng ngừa bệnh lao

Phân tích so sánh hệ gen Mycobacterium cho phép xác định vùng gen

RD1 mã hóa cho các protein kháng nguyên, chỉ có ở M tuberculosis nhưng

vắng mặt trong tất cả các chủng Mycobacterium khác Gen RD1 mã hóa

protein ESAT-6 và CFP-10, là các kháng nguyên protein tiết đặc hiệu của M

tuberculosis có khả năng hoạt hóa các tế bào T tiết ra IFN- γ, trong khi các

kháng nguyên khác có trong BCG hoặc các Mycobacterium khác không có khả năng này

Khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn lao thì tế bào lympho trong máu đã “tiếp

xúc” và có thể “nhận diện” các kháng nguyên của M Tuberculosis Bằng

chứng của đáp ứng miễn dịch từ các tế bào T bị hoạt hóa được ghi nhận bởi sự tiết ra các cytokin và IFN-γ Việc phát hiện và định lượng IFN-γ bằng kỹ thuật ELISA đo lường nồng độ IFN- γ được tiết ra từ các tế bào lympho T máu ngoại vi khi bị kích thích bởi kháng nguyên đặc hiệu là một thử nghiệm in vitro đánh giá gián tiếp đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào của cá thể đó với tình trạng nhiễm lao [52], [63], [89]

TB 7.7 là kháng nguyên glycolipid vi khuẩn lao (TBGL), đã được nghiên cứu với các kỹ thuật ELISpot, với kết quả dương tính là 88% ở đối tượng bệnh lao hoạt động, và 62% ở những người trong vùng dịch tễ của lao [17], [19]

1.3.2 Kỹ thuật in vitro lượng giá đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua việc

đo lường nồng độ IFN-γ tiết ra từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi khi bị kích thích bởi ESAT-6 và CFP-10 và những ứng dụng đã được chấp nhận

Từ những năm 2000, Thử nghiệm in vitro IGRA sử dụng bộ hóa chất QuantiFeron-TB (QFT) lượng giá gián tiếp đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua việc đo lường nồng độ IFN-γ tiết ra từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi khi kích thích bởi tuberculin So sánh với QFT thì chỉ có 83% test tuberculin chẩn đoán dương tính, và 50% TST (Tuberculin skin test) dương tính giả Hệ số phù hợp giữa QFT và TST là 0,6 QFT khắc phục các tồn tại của TST như phản ứng dương giả ở người đã chủng BCG, nhiễm Mycobacterium không lao (non tuberculous mycobacterium) Đến năm 2005, bộ hóa chất QuantiFeron-TB Gold đã được phê duyệt bởi Cục Dược phẩm và Thực phẩm (FDA) [52], [61]

Năm 2005, Trung tâm Kiểm soát và Phòng chống Bệnh tật Hoa kỳ (CDC) công bố hướng dẫn sử dụng bộ hoá chất QuantiFERON-Gold (QFT-G) (Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia) nhằm chẩn đoán nhiễm lao tiềm ẩn và bệnh lao hoạt động thông qua định lượng IFN-γ ở tế bào đơn nhân sau khi kích thích bởi các peptid tổng hợp đặc hiệu cho vi khuẩn lao ESAT-6 và CFP-

10 Thử nghiệm này đã được phê duyệt bởi FDA [45], [73]

Các xét nghiệm QuantiFERON-TB-Gold in tube (QFT-GIT) là thử nghiệm sử dụng thêm kháng nguyên TB 7.7 qua nhiều nghiên cứu đã chứng minh tăng độ nhạy lên 89% và độ đặc hiệu lên 99% [45]

Để được hỗ trợ trong việc phát triển các khuyến cáo liên quan đến sử dụng các kỹ thuật IGRA, CDC đã triệu tập một nhóm các chuyên gia để xem xét các bằng chứng khoa học và cung cấp ý kiến về việc sử dụng các thử nghiệm IGRA Kết quả của nghiên cứu kiểm tra độ nhạy, đặc hiệu là tốt Mặc

dù số liệu về tính chính xác của IGRA và khả năng của chúng để dự đoán bệnh lao hoạt động đến nay vẫn tiếp tục nghiên cứu trong các quần thể khác nhau, nhưng chưa có khiếm khuyết lớn nào đã được báo cáo [73]

Tóm lại, TST và các IGRA (QFT-G, QFT-T, GIT và T-Spot) có thể được sử dụng như hỗ trợ trong chẩn đoán nhiễm trùng lao theo FDA phê chuẩn Đó cũng là cơ sở cho chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tại Việt Nam nhằm

đóng góp những kết quả mới được thực hiện tại tỉnh Bình Định [73]

1.4 TÌNH HÌNH BỆNH LAO

1.4.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG – WHO report 2011 - Global Tuberculosis Control), khoảng một phần ba dân số thế giới đã nhiễm lao Bệnh lao là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai trong các bệnh nhiễm trùng với khoảng 1,2 đến 1,5 triệu người tử vong mỗi năm Tình hình lao kháng thuốc đang xảy ra ở hầu hết các quốc gia

Theo ước tính của TCYTTG, năm 2010 có 8,8 triệu bệnh nhân lao mới, 1,1 triệu người tử vong trong số bệnh nhân lao không nhiễm HIV và khoảng 350.000 bệnh nhân đồng nhiễm lao/HIV tử vong Khoảng 13% bệnh nhân lao

có đồng nhiễm HIV Mặc dù, tình hình bệnh lao có chiều hướng thuyên giảm

kể từ năm 2006, và tỷ lệ mắc lao mới giảm từ năm 2002, bệnh lao vẫn đang là một vấn đề y tế công đồng toàn cầu

Tình hình lao kháng thuốc đang xảy ra ở hầu hết các quốc gia Vấn đề cấp thiết hiện nay là cung cấp những trang bị, kỹ thuật mới như chẩn đoán, thuốc chống lao và văcxin, đặc biệt tại những nơi có tình hình dịch tễ HIV và lao kháng thuốc cao [2], [7], [98], [99]

Trên toàn cầu, khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do bệnh lao là ở các nước có thu nhập thấp và vừa, khoảng 80% số bệnh nhân lao thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao, tỷ lệ điều trị thành công đạt 82% nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% Như vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao chưa được điều trị tiếp tục lây lan cho cộng đồng [7], [97]

Sự gia tăng của bệnh lao trên thế giới có sự góp phần của đại dịch HIV/AIDS và sự kháng thuốc của vi khuẩn lao Theo TCYTTG, đại dịch HIV/AIDS đã làm tăng ít nhất 30% số bệnh nhân lao toàn cầu Đến cuối năm

2006 trên thế giới có khoảng 42 triệu người nhiễm HIV trong đó 50% là đồng nhiễm lao Những người đồng nhiễm lao và HIV có nguy cơ phát triển thành bệnh lao cao gấp 30 lần so với những người chỉ nhiễm lao [6]

1.4.2.Tình hình bệnh lao tại Việt Nam

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2011, TCYTTG ước tính Việt nam đứng thứ 12 trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu:

Bảng 1.1 Tình hình dịch tễ bệnh lao Việt Nam 2011

* Nguồn: Global tuberculosis control 2011 – WHO [ 98],[99 ]

Theo ước tính của TCYTTG, tỷ lệ tử vong do lao là 34/ 100.000 dân, khoảng 29.000 người tử vong do lao Tỷ lệ lao hiện mắc các thể là 334/100.000 dân, khoảng 290.000 bệnh nhân Tỷ lệ lao mới mắc các thể hàng năm là 199/100.000 dân, khoảng 180.000 bệnh nhân [ 98]

Năm 2010, có 42.356 bệnh nhân lao được xét nghiệm HIV, chiếm tỷ lệ 43% tổng số bệnh nhân lao Tỷ lệ HIV dương tính trong số bệnh nhân lao xét nghiệm là 8%, thấp hơn so với tỷ lệ nhiễm HIV ước tính trong số bệnh nhân lao tại báo cáo năm 2010 của TCYTTG (17%) Đồng nhiễm lao/HIV không chỉ làm tăng số bệnh nhân lao, mà còn làm giảm hiệu quả điều trị của CTCLQG và tăng tỷ lệ tử vong do lao Hai cơ chế ngân sách hiện có hỗ trợ cho một số hoạt động phối hợp lao/HIV là Quỹ toàn cầu và Dự án LIFE GAP do PEPFAR hỗ trợ và CDC triển khai Bộ Y tế cùng với CTCLQG và Cục phòng chống HIV/ AIDS đã ban hành quy trình phối hợp về chẩn đoán, điều trị và quản lý các bệnh nhân lao/ HIV [7]

Tỷ lệ lao kháng đa thuốc là 2,7% trong số bệnh nhân lao mới và 19% trong số bệnh nhân lao điều trị lại TCYTTG ước tính năm 2010 có khoảng 3.500 (95% CI: 2.600-4.700) bệnh nhân lao kháng đa thuốc trong số bệnh nhân lao phổi được khám phát hiện [7], [97], [98], [99]

Thành công của CTCLQG trong việc điều trị bệnh nhân và hạn chế lây truyền bệnh lao trong cộng đồng đang bị đe doạ do tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV cao, tình hình bệnh lao kháng thuốc, tình hình chẩn đoán, điều trị bệnh lao còn yếu trong các cơ sở y tế tư nhân; sự tiếp cận không đầy đủ của người nghèo và các nhóm đối tượng đặc biệt đối với các dịch vụ chữa lao chất lượng cao, thiếu hụt ngân sách trong việc cung cấp thuốc cũng như quản lí bệnh nhân lao kháng

đa thuốc, … [2], [6]

Theo kết quả điều tra tình hình nhiễm và mắc lao toàn quốc năm

2006-2007, nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở Việt Nam là 1,67%; tỷ lệ hiện mắc lao phổi AFB (+) các thể ở Việt nam là: 145/ 100.000 dân và tỷ lệ hiện mắc lao phổi AFB (+) mới là: 114/ 100.000 dân Như vậy, vẫn còn một số lượng đáng

kể bệnh nhân lao phổi AFB dương tính trong cộng đồng chưa được phát hiện

và CTCL cần tiếp tục nỗ lực trong công tác phát hiện, quản lí để hạn chế nguồn lây và giảm dịch tễ bệnh lao trong cộng đồng [6]

1.4.3 Tình hình bệnh lao tại tỉnh Bình Định

1.4.3.1 Đặc điểm tình hình

Bình Định là một trong 5 tỉnh nằm trong địa bàn vùng kinh tế trọng điểm miền trung Diện tích tự nhiên toàn tỉnh là 6.024 km2(chiếm 1,8% diện tích cả nước), dân số khoảng 1,6 triệu người (1,9% dân số so với cả nước) Địa hình đa dạng bao gồm: miền núi, đồng bằng, cồn cát ven biển, và hải đảo

Bệnh viện Lao và Bệnh Phổi tỉnh Bình Định là bệnh viện chuyên khoa tuyến tỉnh, thực hiện chức năng khám, chữa bệnh lao và các bệnh phổi đồng thời thực hiện Chương trình Mục tiêu Quốc gia Phòng chống Bệnh lao trên địa bàn tỉnh

Năm 2010, công tác phòng chống lao trên địa bàn tỉnh được sự quan tâm của chính quyền các cấp, cộng đồng, Hội Phụ nữ, Hội Chữ thập đỏ và đặc biệt

là sự đóng góp tích cực của hệ thống y tế tư trong hoạt động phát hiện bệnh nhân lao [2]

1.4.3.2 Tình hình bệnh lao tại tỉnh Bình Định

Bảng 1.2 Tình hình bệnh lao tại Bình Định từ năm 2006 – 2010 [2]

N¨m

Lao phæi AFB(+)

míi

Lao phæi AFB(+) t¸i phát, thÊt b¹i điều trÞ

Lao phæi AFB(-) míi

Lao ngoµi phæi

Bảng 1.3 Kết quả thực hiện năm 2011[2]

2011

Thực hiện

Bảng 1.4 Tình hình thu nhận bệnh nhân lao tại các Huyện, Thành phố [2]

Huyện, Thành phố Chỉ tiêu BN lao các thể 2011 Thực hiện Đạt (%)

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN

ĐỀ TÀI

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước

Bệnh lao là bệnh lây truyền qua đường hô hấp do hít phải không khí

có chứa vi khuẩn lao được sinh ra trong quá trình ho khạc, hắt hơi hay nói chuyện với người bị lao phổi trong giai đoạn tiến triển Do vậy phát hiện sớm

và điều trị sớm làm giảm nhanh chóng khả năng lây truyền bệnh lao Nguy cơ nhiễm lao của người tiếp xúc tùy thuộc vào thời gian tiếp xúc, mức độ tiếp xúc, đậm độ các hạt nhiễm vi khuẩn trong không khí và yếu tố chủ thể Nguy

cơ chuyển từ nhiễm lao sang mắc bệnh lao khoảng 10% trong đời nếu một người nhiễm lao từ lúc nhỏ, tuy nhiên ở người suy giảm miễn dịch như đồng nhiễm HIV thì nguy cơ chuyển từ nhiễm lao sang bệnh lao tăng lên rất cao, khoảng 10%/năm [6], [32]

Không có nhiều các nghiên cứu về miễn dịch trong bệnh lao, các nghiên cứu hầu hết tập trung vào nghiên cứu dịch tễ, lâm sàng Ngày nay, vấn đề nổi trội trong các nghiên cứu về bệnh lao trong nước thuộc về các lĩnh vực lao/HIV, lao kháng thuốc và các bệnh cơ hội khác

Tuy nhiên có một công bố mới nhất năm 2009 thực hiện tại Bệnh viện Lao

và Bệnh phổi Hà Nội của tác giả Lưu Thị Liên và cộng sự sử dụng kỹ thuật IGRA và phản ứng Mantoux thực hiện trên đối tượng là 300 nhân viên y tế làm việc tại bệnh viện, kết quả cho thấy IGRA dương tính 47,3% và phản ứng Mantoux dương tính 61,1% Nhóm nghiên cứu cho rằng “Ước tính tỷ lệ nhiễm lao bằng IGRA hoặc TST trên đối tượng là nhân viên y tế làm việc trong môi trường bệnh viện là cao Chương trình kiểm soát lây nhiễm cần được tăng cường tại Việt Nam Trong cộng đồng không đồng nhất về tiêm chủng BCG, thì IGRA dường như ước tính nhiễm lao chính xác hơn so với các tiêu chuẩn khác như là phản ứng Mantoux” [19], [69]

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Những nghiên cứu về miễn dịch bệnh lao trong những năm gần đây cũng chú tâm nhiều đến các chẩn đoán bệnh lao tiềm ẩn Simsek H năm 2010 tại Thổ Nhĩ Kỳ nghiên cứu so sánh thử nghiệm Tuberculin và T-SPOT- TB để chẩn đoán bệnh lao tiềm ẩn và bệnh lao hoạt tính, nghiên cứu trên 136 đối tượng chia ba nhóm khác nhau (47 bệnh nhân lao phổi hoạt tính, 47 người khỏe mạnh không tiếp xúc bệnh lao và 42 nhân viên y tế có tiền sử tiếp xúc gần với bệnh nhân lao) Kết quả cho thấy độ nhạy của kỹ thuật T- SPOT-TB là 83,0% và giá trị dự báo âm tính là 82,6% ở bệnh lao đang hoạt động; các tỷ lệ này cao hơn có ý nghĩa so với thử nghiệm Mantoux là 38,3% và 60,8%, tương ứng Độ đặc hiệu của T-SPOT.TB là 80,9% thấp hơn so với thử nghiệm Mantoux là 95,7% [89]

Khả năng của T-SPOT-TB và thử nghiệm Tuberculin để chẩn đoán bệnh lao tiềm ẩn là như nhau 54,8%; Nhưng trong chẩn đoán lao hoạt động T-SPOT-TB trội hơn về độ nhạy 83,0% Thử nghiệm T- SPOT-TB được khuyến cáo là cần thiết sử dụng trong các nghiên cứu thuần tập để chẩn đoán bệnh lao

tiềm ẩn [89]

Theo Kumar, năm 2010 tại Ấn Đô, sử dụng xét nghiệm miễn dịch gắn enzym (ELISA) đánh giá khả năng chẩn đoán bệnh lao khi dùng phức hợp kháng nguyên 30/32 kDa (transferase mycolyl-Ag85) và protein đặc hiệu ESAT-6 và CFP-10 Kết quả cho thấy độ nhạy cao 84,1% với phức hợp Ag85,

so với ESAT-6 là 64,9% và CFP-10 là 66%, với độ đặc hiệu tương tự như hầu hết (Ag85: 85,2%, ESAT-6: 88,9%, CFP-10: 85,2%) Như vậy việc sử dụng phức hợp kháng nguyên Ag85 cùng với ESAT-6 và CFP-10 có triển vọng trong việc giảm thiểu sự không đồng nhất trong trường hợp lao hoạt động [63]

Tại Nhật Bản 2010, tác giả Guio và Ashino nghiên cứu dựa trên thử nghiệm ELISpot với kháng nguyên glycolipid vi khuẩn lao Với 17 mẫu nuôi

cấy vi khuẩn lao (+), 13 mẫu chứng từ những người ở trong vùng lưu hành bệnh lao và 13 mẫu chứng từ khu vực không dịch tễ lao Tế bào đơn nhân máu ngoại vi được nuôi cấy trên đĩa đã phủ với kháng thể kháng IFN-γ Phản ứng dương tính với ELISpot là 88%, 62% và 31% ở các nhóm đối tượng bệnh lao, vùng có dịch tễ bệnh lao và vùng không có dich tễ bệnh lao Ngược lại, nồng

độ kháng thể kháng Glycolipid cao ở 12 bệnh nhân lao 71%, nhưng chỉ 8% từ nhóm vùng lưu hành bệnh lao và các thể trong vùng không dịch tễ bênh lao Tác giả kết luận, bệnh lao tiềm ẩn có liên quan đến kết quả ELISpot dương tính và hiệu giá thấp của mức kháng thể kháng TBGL, trong khi kết quả dương tính ELISpot và kháng thể cao ở bệnh nhân lao hoạt động Hiệu giá thấp kháng thể là một dấu hiệu hữu ích để xác định bệnh lao tiềm ẩn trong cá thể có

ELISpot dương tính trong vùng lưu hành bệnh lao [52]

Coral H cho rằng người tiếp xúc trong gia đình của bệnh nhân lao phổi có nguy cơ cao lây nhiễm vi khuẩn lao và phát triển bệnh sớm Xác định các cá thể có nguy cơ bị bệnh lao là một mục tiêu mong muốn để kiểm soát bệnh

lao Xét nghiệm đo lường IFN-γ sử dụng kháng nguyên đặc hiệu của M

tuberculosis để phát hiện nhiễm vi khuẩn lao đã được đề nghị thay thế cho thử

nghiệm tuberculin trên da (TST) Ngoài ra, các mức sản xuất IFN-γ đáp ứng với các kháng nguyên có thể có giá trị dự báo Nhóm nghiên cứu ước tính tỷ lệ nhiễm bệnh lao bởi IGRA và TST trong cộng đồng người tiếp xúc lao, và đánh giá nồng độ IFN-γ tương quan với khả năng phát triển bệnh lao Nghiên cứu trên cộng đồng gồm 2060 người tiếp xúc trong gia đình với bệnh nhân lao và

766 cá nhân từ cộng đồng ở Medellins, Colombia năm 2009; các đối tượng được theo dõi trong 2-3 năm sau khi tiếp xúc bệnh lao Đồng thời với thử nghiệm Tuberculin, đo lượng IFN-γ phản ứng với kháng nguyên ESAT-6, CFP-10, HspX và Ag85A; kết quả được đánh giá ở ngày thứ 7 sau nuôi cấy máu Kết quả TST dương tính 65,9% ở đối tượng tiếp xúc và 42,7% từ cộng đồng (OR 2,60; p <0,0001) Phản ứng IFN-γ dương tính 66,3% trong đối tượng

tiếp xúc và 24,3% từ cộng đồng (OR = 6,07, p <0,0001) Không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các tỉ lệ (-) và (+) của đáp ứng IFN-γ, tuy nhiên, sự phát triển bệnh lao trong số người tiếp xúc có nồng độ IFN-γ cao đã được quan sát (p=0,007) Nhóm nghiên cứu kết luận kỹ thuật đo lượng IFN-γ rất hữu ích để xác định tỷ lệ nhiễm bệnh lao trong số người tiếp xúc bệnh nhân lao và xác định những người có nguy cơ cao phát triển bệnh [46]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu gồm 2 nhóm

2.1.1.Nhóm đối tượng 1

Tiêu chuẩn chọn:

Bệnh nhân: được chẩn đoán bệnh lao phổi có xét nghiệm đàm AFB dương tính (Theo CTCLQG)

Tiêu chuẩn loại trừ:

Bệnh nhân lao có HIV (+), điều trị thuốc ức chế miễn dịch hoặc corticoid kéo dài

2.1.2.Nhóm đối tượng 2

Tiêu chuẩn chọn:

Người tiếp xúc trong gia đình với bệnh nhân lao phổi có AFB (+), thời gian chung sống trong gia đình ≥ 2 tháng

Tiêu chuẩn loại trừ:

Người có HIV (+), điều trị thuốc ức chế miễn dịch hoặc corticoid kéo dài

2.1.3 Nhóm chứng

- Chọn 40 trường hợp khỏe mạnh, không bệnh truyền nhiễm, không tiếp xúc nguồn lây lao, tiền sử không tiêm BCG

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu:

Bệnh Viện lao và Bệnh phổi tỉnh Bình Định và một số phường, xã thuộc tỉnh Bình Định

2.1.5 Thời gian nghiên cứu: 12 tháng (từ tháng 4/2011 đến tháng 4/2012)

2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu:

Nghiên cứu mô tả cắt ngang

+ Hệ số tin cậy 1 -  = 0,95 tương ứng có giá trị Z1-  /2 = 1,96

+ p : Tỉ lệ ước lượng của độ đặc hiệu của thử nghiệm IGRA trên bệnh nhân lao là 0,95 theo tài liệu của CDC [21], [73]

Nhóm đối tượng 2:

tiếp xúc là 66% (nghiên cứu của Coral) và sai số e là 0.07 (7%)

Phương pháp chọn mẫu thuận tiện liên tục kể từ khi bắt đầu cho đến khi

đủ cỡ mẫu, áp dụng cho bệnh nhân được chẩn đoán bệnh lao có xét nghiệm vi khuẩn lao trong đàm dương tính

Nhóm đối tượng 2:

Phương pháp chọn mẫu có chủ đích áp dụng cho người tiếp xúc sống trong gia đình với bệnh nhân lao, thời gian ít nhất 2 tháng

Nhóm chứng:

Phương pháp chọn mẫu có chủ đích áp dụng cho người hoàn toàn khỏe mạnh, có nhóm tuổi giới cùng với nhóm bệnh nhân lao phổi

2.3 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

- Khám lâm sàng, phỏng vấn lập phiếu nghiên cứu

- Xét nghiêm cận lâm sàng: soi tươi đàm, chụp phim phổi, công thức máu,…

- Thử nghiệm IGRA, đánh giá IFN-γ

2.3.1 Kỹ thuật nuôi tế bào và kỹ thuật IGRA (ELISA định lượng IFN-γ, theo quy trình của nhà sản xuất bộ Kit hóa chất)

2.3.1.1 Mô tả và nguyên lý kỹ thuật

Nghiên cứu sử dụng bộ kit “The Gold QuantiFERON ®-TB” chia làm 2 bước:

Bước 1

Ủ tế bào đơn nhân máu ngoại vi (mẫu máu toàn phần) trong ống nghiệm có sẵn môi trường nuôi tế bào và kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT-6 và CFP-10 Thời gian ủ kéo dài từ 16 – 24 giờ, quá trình này làm cho các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (chủ yếu là các lympho T) tiếp xúc với kháng nguyên đặc hiệu Nếu cơ thể đã nhiễm vi khuẩn lao, các tế bào này sẽ nhận diện được các kháng nguyên và bị hoạt hóa làm tiết ra IFN-γ và một số cytokin khác

Sơ đồ 2.1 Ủ tế bào đơn nhân [45]

nguyên ở đại thực bào

đặc hiệu

Bước 2

Sử dụng kỹ thuật ELISA để phát hiện và định lượng lượng IFN-γ có trong phần nước nổi nuôi tế bào Nồng độ IFN-γ là bằng chứng cho thấy có đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào in vitro đối với các kháng nguyên vi khuẩn lao; cho thấy chính cơ thể đó đã nhiễm vi khuẩn lao

Quy trình thực hiện có kèm mẫu chứng âm và chứng dương cho mỗi mẫu máu

2.3.1.2.Quy trình kỹ thuật

Lấy mẫu, nuôi tế bào

Lấy 3 ml máu tĩnh mạch (như quy trình lấy máu tĩnh mạch thường quy) Bơm mỗi 1ml máu vào 3 ống nghiệm:

Ống 1: Ống N (Chứng âm), không chứa kháng nguyên, chỉ có chất

chống đông, môi trường nuôi cấy và lớp gel phân cách (màu xám, ký hiệu Nil)

Ống 2: Ống M (Chứng dương) có chất phân bào, môi trường nuôi cấy

và lớp gel phân cách (màu đỏ, ký hiệu M) và chất chống đông

Ống 3: Ống A (Mẫu thử), chứa kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao

ESAT-6, CFP-10, TB7.7, môi trường nuôi cấy và lớp gel phân cách (màu xanh, ký hiệu A) và chất chống đông

Sau khi bơm và mỗi ống 1 ml máu toàn phần, lắc nhẹ nhàng 10 lần, để hòa trộn chất chống đông và các vật chất trong ống nghiệm Để ống nghiệm tư thế thẳng đứng vào giá ống nghiệm

Ủ mẫu

- Chuyển các ống nghiệm để trên giá ở tư thế thẳng đứng, ủ trong tủ ấm

- Ly tâm ở vận tốc 3000 vòng trong 5 phút

- Lấy phần nước nổi huyết tương cho vào ống nghiệm có ghi mã số bệnh

tháng

2.3.1.3 Kỹ thuật ELISA

Quy trình thực hiện

giờ trước khi sử dụng

số lượng tương ứng với số mẫu

hướng dẫn của bộ hóa chất

gồm 4 nồng độ được ký hiệu như sau: S1: 4 IU/mL, S2: 1 IU/mL, S3: 0.25 IU/mL, và S4: 0 IU/m Mỗi mẫu chứng nên dùng 2 giếng

Sơ đồ 2.2 Pha các dung dịch chuẩn bằng dung dịch pha loãng [45]

toàn Khi dùng pha loãng dung dịch cộng hợp 100 lần trong dung dịch pha loãng Dung dịch cộng hợp đậm đặc phải giữ ngay vào nhiệt độ 2-8

oC

 Huyết tương sau nuôi cấy cần được trộn đều, trước khi dùng Cho vào mỗi giếng thử 50ul dung dịch cộng hợp đã pha loãng 100 lần và 50 µl huyết tương thử nghiệm

giờ Tránh ánh sáng

rửa tương ứng với số giếng thử nghiệm Mỗi giếng cần 400µl cho mỗi lần rửa và rửa 6 lần

thời gian ngâm giữa các chu kỳ là 5 giây

giếng

 Thêm 100µl cơ chất vào mỗi giếng, lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng

dịch dừng phản ứng vào các giếng nên làm theo trình tự ban đầu để bảo đảm thời gian phản ứng là giống nhau

dụng để tính kết quả

2.3.1.4 Kiểm tra chất lượng

về đường chuẩn trước khi nhận định kết quả các mẫu thử

 Giá trị trung bình OD của S1 phải ≥ 0,600 % CV của S1 và S2 phải

≤15%

 Hiệu suất tương quan R (correlation coefficient) từ giá trị OD trung bình của các chuẩn phải ≥ 0,98

 Giá trị OD của S0 (dung dịch pha loãng) ≤ 0,150 Nếu giá trị này

>0,150 thì quy trình rửa nên kiểm tra lại

2.3.2 Hóa chất, sinh phẩm và trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

2.3.2.1.Bộ hóa chất Quantiferon-Gold in tube test (QFT-GIT), hãng sản xuất

Cellesticộng sự , Úc, Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia) Nhà

cung cấp: Công ty TNHH TEKMAX- Hà nội [45]

2.3.2.2 Máy móc và trang thiết bị cơ bản

- Nghề nghiệp: học sinh và sinh viên, cán bộ viên chức, lao động

chân tay, hưu trí và người già, nông dân, khác

- Trình độ học vấn: mù chữ, tiểu học, phổ thông cơ sở, phổ thông

trung học, cao đẳng - đại học -sau đại học

- Nơi ở : thành thị và nông thôn (vùng ven)

2.4.1.2 Các biến số phụ thuộc

- Lâm sàng: sốt, sút cân, ho kéo dài, khạc đàm, đau ngực và khó

thở…

- Cận lâm sàng: tổn thương trên phim X-quang phổi, chỉ số AFB

(soi tươi đàm), số lượng bạch cầu, số lượng tế bào lympho, số lượng hồng cầu

- Các yếu tố nguy cơ: tiền sử chủng BCG, gia đình có người mắc

bệnh lao, các bệnh lý khác kèm theo, hút thuốc lá, uống rượu.v.v

- Đáp ứng miễn dịch tế bào in vitro: tỷ lệ IGRA (+), tỷ lệ IGRA (-),

nồng độ IFN- γ ở các bệnh nhân lao hoạt động

- Nghề nghiệp: học sinh và sinh viên, cán bộ viên chức, lao động

chân tay, hưu trí và người già, nông dân, khác.Trình độ học vấn:

mù chữ, tiểu học, phổ thông cơ sở, phổ thông trung học, cao đẳng - đại học -sau đại học

- Nơi ở : thành thị và nông thôn (vùng ven)

2.4.2.2.Các biến số phụ thuộc

- Lâm sàng: sốt, sút cân, ho kéo dài, khạc đàm, đau ngực và khó

thở…

- Cận lâm sàng: Tổn thương trên phim X-quang phổi, chỉ số AFB

(soi tươi đàm), số lượng bạch cầu, số lượng tế bào lympho, số lượng hồng cầu…

- Các yếu tố nguy cơ: Tiền sử chủng BCG, thời gian tiếp xúc mật

thiết với bệnh nhân lao, quan hệ với người mắc bệnh lao,các bệnh

lý khác kèm theo, hút thuốc lá, uống rượu.v.v

- Đáp ứng miễn dịch tế bào in vitro: tỷ lệ IGRA (+), tỷ lệ IGRA (-),

nồng độ IFN- γ ở người tiếp xúc mật thiết bệnh nhân lao AFB (+) 2.5 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN

2.5.1 Đối tượng 1:

- Khám bệnh, chọn bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn nghiên cứu

- Tư vấn tham gia nghiên cứu, bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên

cứu được đọc phiếu “thỏa thuận tham gia nghiên cứu” hiểu rõ mục đích và quyền lợi khi tham gia nghiên cứu và ký vào phiếu

“thỏa thuận tham gia nghiên cứu” (phụ lục 4: Phiếu thỏa thuận

tham gia nghiên cứu)

- Phỏng vấn trực tiếp, làm hồ sơ bệnh án và lập phiếu nghiên cứu cá

nhân (phụ lục 1): “phiếu thu thập thông tin đối tượng nghiên cứu”

- Thu mẫu máu, tiến hành các xét nghiệm cận lâm sàng và thử

nghiệm IGRA

2.5.2 Đối tượng 2

- Tiếp cận người nhà tiếp xúc với bệnh nhân, chọn người thỏa mãn

tiêu chuẩn nghiên cứu

- Tư vấn tham gia nghiên cứu, bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên

cứu được đọc phiếu “thỏa thuận tham gia nghiên cứu” hiểu rõ mục đích và quyền lợi khi tham gia nghiên cứu và ký vào phiếu

“thỏa thuận tham gia nghiên cứu” (phụ lục 4: Phiếu thỏa thuận

tham gia nghiên cứu)

- Phỏng vấn trực tiếp, lập phiếu nghiên cứu cá nhân (phụ lục 2):

“phiếu thu thập thông tin đối tượng nghiên cứu”

- Thu mẫu máu, tiến hành các xét nghiệm cận lâm sàng và thử

nghiệm IGRA

2.5.3 Đối tượng 3

- Tư vấn tham gia nghiên cứu, đồng ý tham gia nghiên cứu được

đọc phiếu “thỏa thuận tham gia nghiên cứu” hiểu rõ mục đích và quyền lợi khi tham gia nghiên cứu và ký vào phiếu “thỏa thuận

tham gia nghiên cứu” (phụ lục 4)

- Phỏng vấn trực tiếp, lập phiếu nghiên cứu cá nhân (phụ lục 3):

“phiếu thu thập thông tin đối tượng nghiên cứu”

- Thu mẫu máu, tiến hành các xét nghiệm cận lâm sàng và thử

nghiệm IGRA, AFB, phim X-quang tim phổi, SGOT và SGPT

Mô tả và phân tích kết quả nghiên cứu:

* Thiết lập các bảng biểu, đồ thị phù hợp mục tiêu nghiên cứu

* Tính các tham số mẫu: các tỷ lệ, các tần số (n), tổng số (N), số

trung bình (mean), độ lệch chuẩn (SD), tỷ lệ phần trăm (%)

* Một số thuật toán dùng kiểm định [21]:

Ci

Ci) (Oi χ

2 n

1 t



Oi: tần số quan sát; Ci: tần số lý thuyết

* Đánh giá yếu tố nguy cơ bằng tỷ số chênh (OR), 95% CI

* Xác định khác biệt của kiểm định: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05 tương ứng với xác suất sự kiện có thể xảy ra 99,5% và ngược lại

* Đánh giá hiệu quả, xác định kết quả âm tính hay dương tính, độ nhạy (Se), độ đặc hiệu (Sp), giá trị tiên đoán dương tính (PPV), giá trị tiên đoán âm tính (NPV) của một xét nghiệm dựa trên cơ sở phân tích đường cong ROC [21], [31]

Đường cong ROC là một tập hợp các điểm có tọa độ (100-độ đặc hiệu, độ nhạy) trên trục tọa độ X-Y, trong đó: độ nhạy được đặt trên trục Y

là tỷ lệ phần trăm dương tính thật; 100-độ đặc hiệu được đặt trên trục X là

tỷ lệ phần trăm dương tính giả Mỗi 1 điểm tọa độ tương ứng với 1 giá trị ngưỡng chẩn đoán xác định Đường cong càng bị uốn về góc phía trên bên trái của đồ thị thì hiệu lực của nghiệm pháp chẩn đoán càng cao hay chỉ số vùng dưới đường cong AUC càng gần 1 Trái lại, một nghiệm pháp có giá trị AUC < 0,7 sẽ không có khả năng chẩn đoán Góc cận trái trên đường cong là vị trí tối ưu của đồ thị ROC, tương ứng với điểm có tỷ lệ dương tính thật cao và dương tính giả thấp Giá trị ngưỡng ứng với vị trí tối ưu là giá trị

có khả năng phân biệt tốt nhất nhóm dương tính và âm tính

Đường cong ROC được ứng dụng để tìm giá trị ngưỡng giới hạn có hiệu quả chẩn đoán tối ưu [31]

Biểu đồ 2.1 Đường cong ROC tìm giá trị ngưỡng chẩn đoán [31] 2.7 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU

- Bệnh nhân được thông báo mục đích nghiên cứu, nội dung nghiên cứu Bệnh nhân được trao đổi với nghiên cứu sinh khi có vấn đề bất thường

và có quyền tự do quyết định hợp tác hoặc từ chối tham gia nghiên cứu

- Thông tin cá nhân của bệnh nhân được cam kết giữ bí mật (sử dụng biện pháp mã hoá, không nêu tên bệnh nhân)

- Số liệu không được dùng cho bất kỳ một mục đích nào khác

Chương 3 KẾT QỦA NGHIÊN CỨU 3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU

3.1.1 Phân bố các đối tượng theo tuổi, giới, TĐHV, nghề nghiệp

Bảng 3.1 Phân bố theo nhóm tuổi người nhà và bệnh nhân lao phổi

p (1) và (3)

p (2) và (3)

Biểu đồ 3.1 Phân bố theo tuổi

- Nhóm người nhà có BN lao phổi ở nhóm 31-50 tuổi (41,9%)

- Nhóm BN lao phổi ở tuổi >60 chiếm tỷ lệ cao nhất (45,0%)

- Không có sự khác biệt thống kê về tuổi giữa NC và BNLP (p>0,05)