Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (Lates calcarifer Bloch, 1790) đối với vi khuẩn Streptococcus iniae
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - TRẦN VĨ HÍCH NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus iniae LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NHA TRANG – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - TRẦN VĨ HÍCH NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus iniae Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 62 62 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Dũng NHA TRANG – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi kết thu luận án kết nghiên cứu dự án Bệnh cá chẽm, thuộc hợp phần II dự án SRV-2701 Na Uy tài trợ mà thành viên tham gia thực dự án với tư cách nghiên cứu sinh theo kế hoạch hoạt động đào tạo dự án Tôi Chủ nhiệm dự án cho phép sử dụng tất số liệu nghiên cứu cho luận án tiến sĩ Tơi xin cam đoan kết quả, số liệu luận án hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học NGHIÊN CỨU SINH Trần Vĩ Hích i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Ni trồng Thủy sản, Phịng Đào tạo Đại học Sau Đại học, dự án SRV 2701 quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành đề tài nghiên cứu sinh Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Tiến sĩ Nguyễn Hữu Dũng, người định hướng nghiên cứu trực tiếp khuyên bảo giúp đỡ, giải khó khăn vật chất lẫn tinh thần suốt q trình thực đề tài, giúp tơi hiểu rõ giá trị nghiên cứu khoa học Xin cám ơn Phó Giáo sư Tiến sĩ Đỗ Thị Hịa, người dìu dắt tơi từ ngày đầu chập chững đường nghiên cứu khoa học không ngừng dõi theo bước chân Chính Cơ Phó Giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Đình Mão người tạo hội cho trở lại đường nghiên cứu khoa học Cho phép tơi kính gửi lịng biết ơn chân thành đến Giáo sư Heidrun Inger Wergeland, người tận tình hướng dẫn tơi thời gian học tập phương pháp phân tích mẫu Na Uy giúp đỡ việc cơng bố cơng trình nghiên cứu tạp chí quốc tế Xin cám ơn Tiến sĩ Lại Văn Hùng Tiến sĩ Lục Minh Diệp, người tin tưởng động viên nghiên cứu khoa học giúp đỡ vật chất thời gian đầu trình nghiên cứu Cám ơn Tiến sĩ Lê Minh Hoàng, Nghiên cứu sinh Đinh Văn Khương Thạc sĩ Vũ Đặng Hạ Quyên kịp thời cung cấp báo khoa học trình nghiên cứu Xin chân thành cám ơn động viên, khích lệ giúp đỡ Thầy, Cô giáo Khoa Nuôi trồng Thủy sản, cảm ơn em sinh viên ngành Bệnh học thủy sản khóa từ 46BH đến 50BH thực nghiên cứu Lời cảm ơn cuối xin giành cho gia đình tơi: Ba, má, anh chị, vợ tôi, người yêu thương, nâng đỡ vật chất lẫn tinh thần mà từ tơi chưa nói lời cám ơn ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG LUẬN 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌNH HÌNH NI CÁ CHẼM 1.1.1 Một số đặc điểm sinh học cá chẽm 1.1.2 Tình hình ni cá chẽm giới 1.1.2.1 Sản lượng cá chẽm ni giới 1.1.2.2 Các hình thức ni cá chẽm thương phẩm 1.1.3 Tình hình ni cá chẽm Việt Nam 1.1.4 Các bệnh thường gặp cá chẽm nuôi 1.1.4.1 Bệnh virus 1.1.4.2 Bệnh vi khuẩn 1.1.4.3 Bệnh kí sinh trùng 10 1.2 BỆNH DO Streptococcus iniae TRONG NI TRỒNG THỦY SẢN 11 1.2.1 Tình hình dịch bệnh Streptococcus iniae nuôi trồng thủy sản 11 1.2.2 Dấu hiệu bên bệnh Streptococcus inae 13 1.2.3 Giải phẫu bệnh lý cá nhiễm Streptococcus iniae 13 1.2.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn S iniae 14 1.2.5 Biện pháp phòng trị bệnh Streptococcus iniae 16 1.3 HỆ THỐNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƯƠNG 20 1.3.1 Miễn dịch tự nhiên 20 1.3.1.1 Hàng rào vật lý hóa học 20 iii 1.3.1.2 Hàng rào tế bào 21 1.3.1.3 Hàng rào thể dịch 22 1.3.2 Đáp ứng miễn dịch thích ứng 24 1.3.2.1 Hàng rào tế bào đáp ứng miễn dịch thích ứng 24 1.3.2.2 Hàng rào thể dịch đáp ứng miễn dịch thích ứng 25 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch cá 27 1.3.3.1 Các yếu tố ngoại cảnh 27 1.3.3.2 Các yếu tố nội 28 1.3.3.3 Các yếu tố phái sinh 28 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 34 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34 2.3 SƠ ĐỒ KHỐI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (Hình 2.1) 34 2.4 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH MẪU 34 2.4.1 Phân lập xác định đặc điểm vi khuẩn Streptococcus iniae 34 2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn S iniae từ cá chẽm ni Khánh Hịa 34 2.4.1.2 Xác định độc lực vi khuẩn phân lập 37 2.4.1.3 Kiểm tra độ nhạy kháng sinh chủng S iniae phân lập 38 2.4.1.4 Nghiên cứu phương thức xâm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm 38 2.4.1.5 Tính tương đồng kháng nguyên chủng phân lập 39 2.4.2 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch chẽm vi khuẩn S iniae 41 2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu cá chẽm vi khuẩn S iniae ảnh hưởng β-glucan lên đáp ứng miễn dịch 41 2.4.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cá chẽm tế bào vi khuẩn S iniae bất hoạt formalin (Formalin Killed Cell - FKC) 43 2.4.3 Nghiên cứu hình thành phát triển tuyến ức cá chẽm 49 2.4.4 Phương pháp phân tích số liệu 49 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 iv 3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus iniae PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM 50 3.1.1 Phân lập vi khuẩn S iniae từ cá chẽm ni Khánh Hịa 50 3.1.1.1 Tình hình dịch bệnh S iniae gây cá chẽm ni Khánh Hịa 50 3.1.1.2 Đặc điểm phân loại chủng vi khuẩn phân lập 52 3.1.2 Độc lực vi khuẩn S iniae phân lập từ cá bệnh 54 3.1.3 Độ nhạy S iniae với loại kháng sinh 57 3.1.4 Con đường cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm 59 3.1.5 Tính tương đồng kháng nguyên chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập 62 3.2 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM ĐỐI VỚI VI KHUẨN S iniae 64 3.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu cá chẽm vi khuẩn S iniae bất hoạt ảnh hưởng β-glucan đến đáp ứng 64 3.2.1.1 Hoạt tính thực bào số thực bào 64 3.2.1.2 Nồng độ lysozyme huyết cá chẽm 66 3.2.1.3 Khả ức chế vi khuẩn S iniae huyết cá chẽm 67 3.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cá chẽm tế bào vi khuẩn S 70 iniae bất hoạt formalin (FKC) 3.2.2.1 Biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu máu cá thí nghiệm sau tiêm FKC 70 3.2.2.2 Đặc điểm protein kháng nguyên vi khuẩn S iniae 74 3.2.2.3 Hiệu bảo vệ tế bào vi khuẩn bất hoạt (FKC) bệnh Streptococcus iniae gây cá chẽm 76 3.3 SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TUYẾN ỨC 80 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tiếng Việt BA Blood Agar Môi trường thạch máu CFU Colony Forming Unit Đơn vị khuẩn lạc FKC Formalin-Killed Cells Tế bào vi khuẩn bất hoạt formalin IP Intraperitoneal Injection Tiêm vào xoang bụng kDa Kilo Dalton Đơn vị tính khối lượng phân tử protein KF KF-Streptococcus Agar Môi trường nuôi cấy vi khuẩn L-15 Leibovitz Môi trường nuôi cấy tế bào LD50 Lethal Dose 50% Liều gây chết 50% OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch muối sinh lý đệm Phosphate RPP Relative Percent Protection Hệ số bảo vệ tương đối SDS- Sodium Dodecyl Sulfate - Điện di gel polyacrylamide có PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS TSA Tryptic Soy Agar Môi trường nuôi cấy vi khuẩn TSB Tryptic Soy Broth Môi trường ni cấy vi khuẩn xg Gravity Đơn vị tính lực ly tâm vi DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Streptococcus iniae 15 Bảng 1.2 Hiệu bảo vệ loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn S 18 iniae sau bốn tuần tiêm chủng Bảng 1.3 Nguồn gốc tác dụng cytokin cá 29 Bảng 1.4 Sự hình thành quan mơ lympho số loài cá 32 Bảng 3.1 Nguồn phân lập chủng S iniae từ cá chẽm nuôi Khánh Hòa 50 Bảng 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ cá 53 chẽm ni Khánh Hịa Bảng 3.3 Độ nhạy cảm chủng vi khuẩn S iniae phân lập từ cá chẽm 58 ni Khánh Hịa 12 loại kháng sinh phổ biến nuôi trồng thủy sản Bảng 3.4 Thời điểm phát vi khuẩn S iniae quan cá chẽm vii 59 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Sản lượng giá trị cá chẽm nuôi giới từ năm 1959 – 2009 Hình 1.2 Tỉ lệ sản lượng cá chẽm nuôi nước với tổng sản lượng cá chẽm nuôi giới từ năm 1959-2009 Hình 1.3 Một số bệnh thường gặp cá chẽm ni 10 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 35 Hình 2.2 Phương pháp xác định kháng thể kháng S iniae huyết 45 cá chẽm Hình 3.1 Cá chẽm mắc nhiễm Streptococcus iniae ni Khánh Hịa 51 Hình 3.2 Hình dạng khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn S iniae phân 52 lập từ cá chẽm ni Khánh Hịa Hình 3.3 Tỉ lệ chết tích lũy nhóm cá chẽm thí nghiệm sau tiêm S 55 iniae vào xoang bụng với nồng độ khác Hình 3.4 Tương quan nồng độ vi khuẩn S iniae tiêm vào xoang bụng 56 tỉ lệ chết tích lũy nhóm cá chẽm thí nghiệm Hình 3.5 Mang cá chẽm nhuộm mơ hóa miễn dịch với vi khuẩn mang sơ 59 cấp, mang thứ cấp xoang tĩnh mạch mang Hình 3.6 Thận cá chẽm nhiễm S iniae nhuộm mơ hóa miễn dịch 60 Hình 3.7 Một số quan cá chẽm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae sau 61 nhuộm mơ hóa miễn dịch Hình 3.8 Hiệu giá kháng thể huyết cá chẽm chủng S 63 iniae khác Hình 3.9 Hoạt tính thực bào đại thực bào cá chẽm trước sau tiêm 64 vi khuẩn S iniae Hình 3.10 Các tế bào nấm men bị thực bào đại thực bào phân lập từ 65 tiền thận cá chẽm Hình 3.11 Chỉ số thực bào đại thực bào cá chẽm trước sau tiêm 65 viii 1.5 Kết giải trình tự gen 16S vi khuẩn NH081011P 119 120 1.6 Kết giải trình tự gen 16S vi khuẩn NH081107P 121 122 1.7 Kết giải trình tự gen 16S vi khuẩn CR091016P 123 124 1.8 Kết giải trình tự gen 16S vi khuẩn CR091122P 125 126 Phụ lục Bảng thông số đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Bảng pl2 Chỉ số thực bào đại thực bào cá chẽm trước sau tiêm vi khuẩn Streptococcus iniae Đơn vị tính: Số lượng tế bào nấm men bị bắt giữ đại thực bào Nghiệm Chỉ số thực bào đại thực bào cá chẽm thời điểm (giờ) thức 12 24 36 48 60 72 84 96 Glucan + FKC FKC 2,14 ± 0,29 3,24 ± 0,26 2,86 ± 0,11 2,03 ± 0,32 2,15 ± 0,12 1,87 ± 0,29 2,16 ± 0,14 1,90 ± 0,19 2,02 ± 0.25 1,95 ± 0,27 3,25 ± 0,3 3,16 ± 0,29 2,06 ± 0,12 2,09 ± 0,2 2,19 ± 0,14 1,88 ± 0,1 1,95 ± 0,25 2,07 ± 0,3 Đối chứng 1,97 ± 0,04 2,00 ± 0,19 2,06 ± 0,14 2,05 ± 0,09 2,03 ± 0,16 2,06 ± 0,04 1,99 ± 0,13 1,93 ± 0,12 2,11 ± 0,11 Số liệu trình bày: trung bình ± độ lệch chuẩn Bảng 2.pl2 Hoạt tính thực bào đại thực bào cá chẽm trước sau tiêm vi khuẩn Streptococcus iniae Đơn vị tính: Số lượng tế bào thực bào 100 đại thực bào Nghiệm thức Hoạt tính thực bào (%) đại thực bào cá chẽm thời điểm (giờ) 12 24 36 48 60 72 84 96 Glucan + FKC 79,83 ± 4,73 80,44 ± 6,0878,35 ± 5,3949,42 ± 4,0148,71 ± 8,17 49,53 ± 2,9452,54 ± 13,3650,35 ± 8,0547,39 ± 6,17 FKC 46,77 ± 10,31 78,36 ± 6,3374,92 ± 5,78 53,69 ± 3,2 49,87 ± 7,07 53,24 ± 4,64 50,22 ± 9,95 40,4 ± 5,69 44,88 ± 0,83 Đối chứng 48,02 ± 4,93 51,28 ± 5,83 50,51 ± 3,20 48,16 ± 3,25 51,84 ± 5,81 51,61 ± 4,63 47,04 ± 6,31 48,08 ± 6,41 46,38 ± 8,25 Số liệu trình bày: trung bình ± độ lệch chuẩn 127 Bảng 3.pl2 Nồng độ lysozyme huyết cá chẽm trước sau tiêm vi khuẩn Streptococcus iniae Nghiệm Nồng độ lysozyme (µg/mL) huyết cá chẽm thời điểm (giờ) thức 12 24 36 48 60 72 84 96 Glucan 11,84 ± 11,47 ± 13,46 ± 14,78 ± 15,05 ± 16,05 ± 18,48 ± 21,72 ± 20,96 ± + FKC 1,70 1,42 1,07 0,74 1,05 0,38 0,22 1,65 1,63 6,38 ± 9,56 ± 9,42 ± 10,2 ± 12,34 ± 12,41 ± 14,97 ± 16,07 ± 19,27 ± 1,57 0,55 0,90 0,98 0,52 0,41 0,45 1,45 1,68 6,64 ± 7,15 ± 6,99 ± 6,40 ± 7,27 ± 7,21 ± 6,74 ± 7,11 ± 7,28 ± 1,62 1,63 0,93 1,43 1,16 1,60 0,66 0,98 0,84 FKC Đối chứng Số liệu trình bày: trung bình ± độ lệch chuẩn Bảng pl2 Tỉ lệ (%) vi khuẩn bị ức chế huyết cá chẽm sau tiêm vi khuẩn Streptococcus iniae Nghiệm Tỉ lệ vi khuẩn S iniae (%) bị ức chế huyết cá chẽm thời điểm (giờ) thức 12 24 36 48 60 72 84 96 Glucan 38,41 ± 43,47 ± 56,17 ± 60,86 ± 63,08 ± 67,07 ± 74,83 ± 73,09 ± 76,42 ± + FKC 0,74 1,68 2,44 3,09 5,1 5,24 5,94 2,17 2,8 26,77 ± 39,49 ± 47,22 ± 52,43 ± 53,26 ± 57,67 ± 58,38 ± 61,36 ± 2,09 2,75 3,69 4,6 5,7 5,58 2,22 4,8 FKC Số liệu trình bày: trung bình ± độ lệch chuẩn 128 Phụ lục Biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu kháng vi khuẩn S iniae huyết cá chẽm Đơn vị tính: mật độ quang bước sóng 492nm thực ELISA với độ pha loãng huyết 1:100 Nghiệm cá thức thứ Hàm lượng kháng thể đặc hiệu kháng vi khuẩn S iniae huyết cá chẽm thời điểm (ngày) sau tiêm vaccine 14 21 28 35 42 49 56 0.09 0.09 0.03 0.03 0.06 0.06 0.08 0.03 0.13 0.12 0.04 0.04 0.02 0.03 0.06 0.05 0.04 0.01 0.09 0.05 0.01 0.02 0.25 0.08 0.01 0.08 0.07 0.09 0.12 0.21 0.01 0.06 Đối 0.15 0.07 0.14 0.04 0.23 0.1 0.04 0.07 chứng 0.09 0.07 0.13 0.11 0.07 0.04 0.04 0.07 0.12 0.12 0.08 0.08 0.06 0.14 0.04 0.21 0.05 0.08 0.13 0.04 0.13 0.03 0.06 0.01 0.11 0.09 0.09 0.08 0.09 0.09 0.08 0.01 10 0.08 0.12 0.12 0.05 0.12 0.12 0.12 0.01 Trung bình 0.09 0.09 0.09 0.06 0.09 0.08 0.08 0.06 0.1 0.23 0.34 0.22 0.62 0.63 1.21 0.74 0.02 0.33 0.46 0.33 0.5 1.24 0.92 0.32 0.14 0.12 0.26 0.49 0.56 0.69 0.56 0.15 0.04 0.5 0.29 0.09 0.33 0.53 0.88 0.69 0.32 0.34 0.32 0.1 0.53 1.34 0.68 0.57 0.34 0.6 0.19 0.08 0.52 1.4 0.9 0.51 0.16 0.45 0.32 0.27 0.79 1.1 1.1 0.37 0.22 0.07 0.24 0.16 0.36 0.61 0.67 0.67 0.19 0.46 0.38 0.14 0.82 0.7 0.72 0.3 10 0.1 0.6 0.6 0.31 0.31 1.2 0.94 0.45 0.16 0.37 0.34 0.22 0.53 0.94 0.86 0.48 Vaccine Trung bình 129 Phụ lục Xử lý số liệu khối lượng trung bình cá thí nghiệm đánh giá tính an toàn vi khuẩn bất hoạt (FKC) t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances cá tiêm FKC cá đối chứng Khối lượng trung bình (g) 14.693333 14.36 Variance 5.1158161 6.535586207 30 30 Observations Pooled Variance 5.8257011 Hypothesized Mean Difference df 58 t Stat 0.5348725 P(T