Nghiên cứu khả năng phòng trừ và trị bệnh của dich ép lá ổi đối với vi khuẩn streptococcus spp gây ra trên cá trê lai (clarias macrocephalus female x clarias gariepinus male)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ HỒN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHỊNG VÀ TRỊ BỆNH CỦA DỊCH ÉP LÁ ỔI ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus spp GÂY RA TRÊN CÁ TRÊ LAI (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) KHãA LN TèT NGHIƯP NGµNH Kỹ SƯ NUÔI TRồNG THủY SảN VINh - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH CỦA DỊCH ÉP LÁ ỔI ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus spp GÂY RA TRÊN CÁ TRÊ LAI (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) KHóA LUậN TốT NGHIệP NGàNH Kỹ SƯ NUÔI TRồNG THủY SảN Ng-ời thực hiện: Nguyễn Thị Hoàn Ng-ời h-ớng dẫn: ThS Tr-ơng Thị Thành Vinh Vinh - 2012 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt khố luận tốt nghiệp này, cố gắng nỗ lực thân, tơi cịn nhận giúp đỡ nhiều tập thể cá nhân Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến ThS Trương Thị Thành Vinh – giảng viên khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh, người định hướng hướng dẫn nhiệt tình, chu đáo suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Đồng thời xin chân thành cảm ơn cô giáo Nguyễn Thị Kim Chung giáo viên phịng thí nghiệm khoa Nơng Lâm Ngư tạo điều kiện để tơi hồn thành đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa tồn thể thầy giáo khoa Nơng Lâm Ngư, trường Đại học Vinh dạy dỗ, trang bị cho tảng kiến thức giúp đỡ suốt năm học qua Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất bạn bè, tập thể lớp 49K2 – NTTS người bên cạnh, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Cuối với tất lịng biết ơn kính trọng xin gửi tới bố mẹ, em tồn thể đại gia đình chăm sóc, ni dạy giành cho tơi tình cảm tốt đẹp nhất! Vinh, tháng 05 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Hoàn DANH MỤC VIẾT TẮT TT Viết tắt Viết đầy đủ CN Công nghệ ctv Cộng tác viên KH Khoa học KH & CN Khoa học công nghệ ĐBSCL Đồng sông Cửu Long NA Nutrien Aga NXB Nhà xuất NTTS Nuôi trồng thủy sản ThS Thạc sĩ 10 TS Tiến Sĩ 11 ĐVTS Động vật thủy sản 12 NT Nghiệm thức DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các nghiệm thức thí nghiệm 24 Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm 29 Bảng 3.1 Khả kháng vi khuẩn Streptococcus spp ổi loại kháng sinh 30 Bảng 3.2 Diễn biến bệnh lý cá sau cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus spp thí nghiệm 33 Bảng 3.3 Tỷ lệ cá có biểu bệnh lý tỷ lệ chết sau ngày cảm nhiễm 37 Bảng 3.4 Kết phân lập vi khuẩn gây bệnh lở loét cá trê lai 39 Bảng 3.5 Diễn biến bệnh lý cá sau cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus spp thí nghiệm 40 Bảng 3.5 Tỷ lệ cá chết sau ngày cảm nhiễm 43 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cá trê lai Hình 1.2 Vi khuẩn Streptococcus spp Hình 1.3 Lá ổi Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 19 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 20 Hình 2.3 Các buớc pha lỗng nồng độ vi khuẩn 21 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23 Hình 2.5 Mơ hình thí nghiệm 24 Hình 2.6 Đường cấy vi khuẩn đĩa lồng 26 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 27 Hình 2.8 Mơ hình thí nghiệm 28 Hình 3.1 Đường kính vịng vơ khuẩn dịch ép ổi loại kháng sinh vi khuẩn Streptococcus spp 31 Hình 3.2 Đường kính vịng vơ khuẩn dịch ép ổi loại kháng sinh vi khuẩn Streptococcus spp 31 Hình 3.3 Tỷ lệ cá có biểu bệnh lý sau cảm nhiễm vi khuẩn 34 Hình 3.4 Tỷ lệ cá chết sau cảm nhiễm vi khuẩn 36 Hình 3.5 Cá bị bệnh chết NT4 36 Hình 3.6 Cá bị bệnh NT 36 Hình 3.7 Cá bị bệnh gan phù nề 38 Hình 3.8 Ni cấy vi khuẩn từ cá bị bệnh 38 Hình 3.9 Nhuộm gram vi khuẩn từ cá bị bệnh 38 Hình 3.10 Tỷ lệ cá có biểu bệnh lý sau cảm nhiễm vi khuẩn 41 Hình 3.11 Cá lờ đờ mặt nước 41 Hình 3.12 Cá bị bệnh sau ngày cảm nhiễm NT 41 Hình 3.13 Cá có biểu lành bệnh sau ngày NT1 41 Hình 3.14 Tỷ lệ cá chết sau cảm nhiễm 43 MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Danh mục viết tắt ii Danh mục bảng iii Danh mục hình iv Mục lục vi Mở đầu Chương Tổng quan tài liêu 1.1 Vài nét đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Cá trê lai 1.1.2 Vi khẩn Streptococcus spp 1.1.3 Lá ổi 1.2 Những hạn chế việc sử dụng kháng sinh phòng, trị bệnh cho ĐVTS 1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược phòng, trị bệnh nhiễm khuẩn động vật thủy sản 11 1.3.1 Trên giới 11 1.3.2 Ở Việt Nam 14 Chương Đối tượng, vật liệu, địa điêm, nội dung phương pháp nghiên cứu 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Vật liệu nghiên cứu 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu 19 2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20 2.4.3 Phương pháp xử lí số liệu 29 2.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu 29 2.5.1 Thời gian nghiên cứu 29 2.5.2 Địa điểm nghiên cứu 29 Chương Kết nghiên cứu thảo luận 30 3.1 Kết thử kháng sinh đồ dịch ép ổi vi khuẩn Streptococcus spp 30 3.2 Khả phòng bệnh dịch ép ổi vi khuẩn Streptococcus spp gây cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) 32 3.3 Khả trị bệnh dịch ép ổi vi khuẩn Streptococcus spp gây cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) 39 Kết luận kiế nghị 45 Tài liệu tham khảo 46 Phụ lục MỞ ĐẦU Thủy sản ngành nghề phát triển lâu đời giữ vai trò quan trọng kinh tế nước ta Theo thống kê ngành tạo nên sản phẩm nông nghiệp cho giá trị xuất cao Cụ thể, vào năm 2010 kim ngạch xuất thủy sản đạt 4,95 tỷ USD số mặt hàng khác lâm sản - đồ gỗ 3,63 tỷ USD; gạo 3,2 tỷ USD; cao su 2,3 tỷ USD; cà phê 1,76 tỷ USD hạt điều 1,1 tỷ USD [26] Qua thấy kim ngạch xuất hàng hóa thủy sản chiếm tỷ trọng tương đối lớn Trong ngành ni trồng thủy sản nước đóng góp phần vào sản lượng ngành thủy sản Cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) loài cá dễ ni có khả chống chịu với mơi trường khắc nghiệt Vì vậy, đối tượng năm qua nuôi phổ biến Song người nuôi cịn gặp số khó khăn bất cập thị trường chưa thực ổn định bị tác động dịch bệnh Một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho đối tượng cá trê lai nói riêng cho cá nước nói chung vi khuẩn Streptococcus spp Ở nước ta, dù chưa xảy trận dịch nghiêm trọng có thiệt hại cảnh báo dịch bệnh đối tượng gây Ước tính thiệt hại năm khoảng 150 triệu USD [13] Một giải pháp để phòng trị bệnh vi khuẩn sử dụng loại kháng sinh, nhiên dao hai lưỡi Nếu sử dụng kháng sinh khơng cách khơng tác động chữa bệnh cho đối tượng mà ảnh hưởng xấu tới sức khỏe động vật nuôi, môi trường sinh thái có khả tạo dịng vi khuẩn kháng thuốc Ngoài việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh động vật thủy sản để lại dư lượng sản phẩm gây hại cho người tiêu dùng khả tiêu thụ sản phẩm 10 tác dụng làm cá có dấu hiệu bệnh lý Ở NT 1, NT 2, NT tỷ lệ cá có biểu bệnh lý tăng tăng chậm nhiều so với NT Sau cảm nhiễm ngày tỷ lệ có biểu bệnh lý NT 49,74%, NT NT 7,41% Lúc NT NT có chững lại giảm xuống Tại số lượng cá kiểm tra lúc giảm lượng cá có biểu bệnh khơng tăng lên Ở NT tỷ lệ cá có biểu bệnh tăng lên có chết có biểu bệnh lý (bảng 3.2) Sau ngày cảm nhiễm tỷ lệ cá có biểu bệnh lý Ở NT 1, NT giảm số lượng cá kiểm tra giảm Vì vào thời điểm cá NT chết con, NT chết (bảng 3.2) Sau ngày theo dõi tỷ lệ cá có biểu bệnh lý NT NT thấp 3,70% số cá kiểm tra Cịn tồn cá NT có biểu bệnh lý số chết Qua thấy rằng, sau thời gian cảm nhiễm NT xuất dấu hiệu bệnh lý Nhưng NT 1, NT NT tỷ lệ cá có biểu bệnh lý thấp NT Chứng tỏ dịch ép ổi có khả phịng bệnh vi khuẩn Streptococcus spp gây cá trê lai Với liều lượng 200ml/kg thức ăn NT tỷ lệ cá có biểu bệnh lý qua ngày thấp so với NT (thức ăn khơng có thảo dược) cao so với NT (300ml/kg TA) NT (400ml/kg TA) Khả phòng bệnh dịch ép ổi mức 200ml/kg TA mức 300ml/kg TA 400ml/kg TA Còn NT NT có tương đương khả phòng bệnh dịch ép ổi Với xuất bệnh lý tỷ lệ chết NT xảy Cùng với quan sát dấu hiệu bệnh lý tỷ lệ chết nghiệm thức có vai trị quan trọng để đánh giá khả phòng bệnh dịch ép ổi 44 Hình 3.4 Tỷ lệ cá chết sau cảm nhiễm vi khuẩn Qua kết ta thấy tỷ lệ cá có biểu bệnh lý thấp tỷ lệ chết thấp Sau ngày cảm nhiễm, cá có biểu bệnh lý sau ngày cảm nhiễm nghiệm thức chưa xảy tượng cá chết Đến ngày thứ xuất số chết Chứng tỏ sau thời gian xuất dấu hiệu bệnh lý cá chết Điều theo quy luật tự nhiên Sau cá bị bệnh với biểu loét thân, bỏ ăn làm cá yếu dần chết Hình 3.5 Cá bị bệnh chết NT Hình 3.6 Cá bị bệnh NT Sau cảm nhiễm ngày, NT với tỷ lệ 100% cá có biểu bệnh lý tỷ lệ cá chết cao tới 26,67% Còn NT NT có tỷ lệ chết ngang (Hình 3.3) NT có tỷ lệ cá chết thấp NT cao so với NT NT 45 Sau cảm nhiễm ngày, NT có tỷ lệ chết tỷ lệ cá biểu bệnh lý cao (qua hình 3.3 hình 3.4) Bảng 3.3 Tỷ lệ cá có biểu bệnh lý tỷ lệ chết sau ngày cảm nhiễm Nghiệm thức Tỷ lệ cá biểu bệnh lý Tỷ lệ chết NT1 42,22±22,69b 43,33±5,77b NT2 3,70±6,41c 16,67±11.55c NT3 3,70±6,41c 13,33±5,77c NT4 100,0±0,00a 63,33±15,28a (Số liệu cột có ký hiệu số mũ khác thể mức sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05) Tỷ lệ cá chết sau cảm nhiễm ngày NT cho ăn thức ăn có chứa thảo dược thấp so với NT cho ăn thức ăn thảo dược Vậy việc sử dụng TA có thảo dược để phòng bệnh hạn chế cá chết hàng loạt Điều cho thấy sử dụng thức ăn có thảo dược làm tăng sức đề kháng cá Đặc biệt NT NT (bảng 3.3) Xét mặt tốn học tỷ lệ cá biểu bệnh lý tỷ lệ cá chết NT khác Kiểm định LSD0,05 cho thấy khác NT cho ăn thức ăn có chứa thảo dược với NT cho ăn thức ăn khơng có thảo dược có ý nghĩa thống kê (P 0,05) Cho thấy TA có lượng thảo dược 200ml/kg TA có khả phịng 46 bệnh vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh cá trê lai thấp so với 300ml/kg TA 400ml/kg TA Tỷ lệ cá chết NT thấp so với NT Kết phân tích ANOVA, kiểm định LSD0,05 cho thấy sai khác khơng có ý nghĩa (P> 0,05), điều chứng tỏ khả phòng bệnh dịch ép ổi NT tương đương Theo kết thu dịch ép từ ổi cho thấy lượng dịch ép thu khó khăn (1kg ổi tươi thu 20ml dịch ép nồng độ 100%) Do đó, sử dụng lượng dịch ép ổi thức ăn mức 300ml/kg thức ăn mang lại hiệu phịng bệnh giảm chi phí kinh tế Sau lần cá chết chúng tơi có tiến hành thu mẫu xác định lại tác nhân gây bệnh đối tượng Kết cho thấy mẫu gan thận cá có vi khuẩn Streptococcus spp Hình 3.7 Cá bị bệnh gan phù nề Hình 3.8 Ni cấy vi khuẩn từ cá bị bệnh Hình 3.9 Nhuộm gram vi khuẩn từ cá bị bệnh 47 Bảng 3.4 Kết phân lập vi khuẩn gây bệnh lở loét cá trê lai Đặc điểm sinh hóa Gram Hình dạng tế bào Hình dạng khuẩn lạc Màu khuẩn lạc Kích thước Phát triển môi trường NA Khả di động Tên giống Chủng + Hình cầu Trịn Màu trắng 1-2 µm + Streptococcus spp 3.3 Khả trị bệnh dịch ép ổi vi khuẩn Streptococcus spp gây cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) Trị bệnh nuôi trồng thủy sản thường sử dụng kháng sinh Nó giúp nhanh chóng giảm tỷ lệ chết bị bệnh có nhược điểm mà ta nên thay thảo dược Theo thí nghiệm thí nghiệm dịch ép ổi có khả kháng vi khuẩn Streptococcus spp có khả phòng bệnh vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh cá trê lai với liều lượng 300ml/kg Vì thí nghiệm chúng tơi sử dụng liều lượng dịch ép ổi 300ml/kg thức ăn để tiến hành thí nghiệm trị Sau ni tiến hành cảm nhiễm cho cá theo dõi bệnh lý cá 48 Bảng 3.5 Diễn biến bệnh lý cá sau cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus spp Sau cảm NT1 nhiễm ngày Cá hoạt động bình thường hoạt động yếu, cịn lại hoạt ngày động bình thường, bị tổn thương vết tiêm 13 xuất huyết thân, ngày số hoạt động chết có dấu hiệu xuất huyết thân 11 có vết ngày loét thân hoạt động kém, bơi lờ đờ mặt nước chết có vết loét thân Các cịn lại có 11 có vết lt thân ngày hoạt động kém, bơi lờ đờ mặt nước Nhưng có có biểu lành dần vết loét thân chết Các lại tượng loét thân ngày có 12 biểu lành vết loét thân chết Có 10 có vết loét thân có xu hướng lành ngày vết loét thân, hoạt động bình thường khơng xuất thêm chết có biểu bệnh, biểu lành hẳn vết loét ngày thân hoạt động bình thường Cịn có biểu lành dần vết loét thân không xuất thêm chết có biểu bệnh, thơi ngày bệnh lại biểu lành vết loét thân, hoạt động bình thường 49 NT2 Cá hoạt động bình thường Tồn bị tổn thương vết tiêm, hoạt động yếu bơi lờ đờ mặt nước có 15 có tượng xuất huyết, số hoạt động chết có dấu hiệu xuất huyết thân, cịn lại có xuất vết loét thân có hoạt động kém, bơi lờ đờ mặt nước chết cịn lại có biểu xuất huyết có hoạt động yếu, bơi lờ đờ mặt nước chết, cịn lại có dấu hiệu lt phần thân, hoạt động yếu chết, cịn lại có biểu xuất huyết phần lưng, bơi lờ đờ, bỏ ăn chết, cịn lại có tượng loét phần thân, hoạt động kém, bơi lờ đờ bỏ ăn chết, lại có tượng loét phần thân, hoạt động kém, bơi lờ đờ bỏ ăn Hình 3.10 Tỷ lệ cá có biểu bệnh lý sau cảm nhiễm vi khuẩn Sau ngày cảm nhiễm cho cá, số có dấu hiệu hoạt động NT Đến ngày thứ cá có dấu hiệu loét vùng thân Hình 3.11 Cá lờ đờ mặt nước Hình 3.12 Cá bị bệnh sau ngày cảm nhiễm NT Hình 3.13 Cá có biểu lành bệnh sau ngày NT1 50 Ngày thứ 4, NT xuất cá chết tất cá NT có dấu hiệu bệnh lý loét thân số hoạt động Số lượng chết thời điểm hoạt động vào thời điểm trước Do hoạt động nên khả bắt mồi tiêu thụ thức ăn cá hạn chế Vì NT 1, số khơng sử dụng thức ăn có thảo dược Cho ta thấy, nuôi trồng thủy sản đối tượng ni có biểu bệnh lý ta cần kịp thời chữa trị để tránh việc cá không sử dụng thức ăn có chứa thuốc Sẽ làm lãng phí thuốc khơng hiệu điều trị Hình 3.10 biểu thị NT vào ngày thứ sau cảm nhiễm tỷ lệ cá có biểu bệnh lý cao q trình làm thí nghiệm Từ ngày thứ 4, thứ thứ sau cảm nhiễm tỷ lệ cá biểu bệnh lý chững lại giảm dần ngày tiếp Việc sử dụng TA có chứa thảo dược để trị bệnh NT có tác dụng thể tỷ lệ cá có biểu bệnh lý số cá khỏi bệnh dần ngày theo dõi (bảng 3.2) Sau cảm nhiễm ngày (hay sau sử dụng TA có chứa thảo dược ngày ăn sau cảm nhiễm) Hình 3.10 biểu thị tỷ lệ cá có dấu hiệu bệnh lý NT tăng nhanh sau cảm nhiễm Sau cảm nhiễm ngày có 100% cá có dấu hiệu bệnh lý thời điểm xuất số chết Tỷ lệ cá có biểu bệnh lý NT không giảm đồng thời có số lượng cá chết Ta thấy sử dụng dịch ép ổi bổ sung vào thức ăn tác nhân gây bệnh xâm nhập vào thể làm giảm tỷ lệ cá có biểu bệnh lý có biểu khỏi bệnh 51 Hình 3.14 Tỷ lệ cá chết sau cảm nhiễm Sau ngày cảm nhiễm tỷ lệ chết NT 0% Với tỷ lệ cá có biểu bệnh lý NT lớn NT tỷ lệ cá chết NT sau ngày, ngày, ngày cao so với NT Các ngày thứ 5, 6, 7, sau cảm nhiễm NT có biểu lành vết loét ngày thứ sau tiêm không xuất cá chết Như dịch ép ổi có tác dụng trị bệnh vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh cá trê lai Bảng 3.6 Tỷ lệ cá có biểu bệnh lý tỷ lệ cá chết sau ngày cảm nhiễm Nghiệm thức Tỷ lệ biểu bệnh lý Tỷ lệ chết (%) NT1 16,67±7,22b 16,67±5,77b NT2 100,0±0,00a 93,33±5,77a (Số liệu cột có ký hiệu số mũ khác thể mức sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05) Kết thể bảng 3.5, tỷ lệ cá có biểu bệnh lý tỷ lệ cá chết NT không cho ăn thức ăn thảo dược cao nhiều so với NT cho ăn thức ăn thảo dược Với khác có ý nghĩa thống kê (P