tóm tắt luận án nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (lates calcarifer bloch, 1790) đối với vi khuẩn streptococcus iniae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN VĨ HÍCH NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus iniae TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Nha Trang - 2014 Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Dũng Phản biện 1: ……………………………………. Phản biện 2: ……………………………………. Phản biện 3: ……………………………………. Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại Trường Đại học Nha Trang vào hồi … giờ .…. ngày …… tháng …… năm 2014 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện trường Đại học Nha Trang 2 MỞ ĐẦU Cá chẽm là đối tượng có giá trị kinh tế cao đã được nuôi thương phẩm khá lâu năm ở các nước châu Á và Úc. Trong suốt quá trình nuôi, cá chịu tác động nhiều nhất bởi vi khuẩn S. iniae. Đã có nhiều phương pháp phòng và trị bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm đã được sử dụng như: dùng kháng sinh, probiotic hay các chất kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Tuy nhiên trong khi các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng thì việc sử dụng prob iotic hay các chất kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu vẫn chưa đem lại hiệu quả thực sự. Vaccine được thừa nhận là giải pháp tốt nhất trong việc phòng bệnh do S. iniae gây ra và hiện tại, một số vaccine phòng bệnh do S. iniae gây ra đã có trên thị trường. Thế nhưng thời gian bảo hộ của vaccine thay đổi tùy thuộc vào thành phần vaccine, phương thức dẫn truyền vaccine…trong khi những tha y đổi mạnh mẽ của vi khuẩn này nhằm thích nghi với môi trường đòi hỏi các nghiên cứu nhằm tạo ra các loại vaccine có hiệu lực cao vẫn phải được tiếp tục. Hơn nữa, hiệu quả bảo vệ của vaccine cũng phụ thuộc vào khả năng tiếp nhận vaccine của từng loài cá, tuổi cá… trong lúc có quá ít thông tin về đáp ứng miễn dịch của cá chẽm chống lại bệnh do S. i niae gây ra và hầu như không có thông tin về sự phát sinh và phát triển của hệ thống miễn dịch cá chẽm. Vì thế cần phải có nhiều nghiên cứu về các vấn đề nêu trên làm cơ sở cho việc xây dựng các biện pháp phòng bệnh sớm cho cá chẽm dựa trên các phương pháp miễn dịch. Từ thực tiễn nêu trên, đề tài: ”Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (Lates calcarifer Bloch 1790) đối với vi khuẩn Streptococcu s iniae” được thực hiện. Mục tiêu của đề tài: 1 Cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các biện pháp phòng bệnh sớm cho cá chẽm bằng phương pháp miễn dịch học Các nội dung chính của đề tài: 1. Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 2. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 4. Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng vi khuẩn bất hoạt trong phòng bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm. 5. Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này đã bổ sung các hiểu biết về hệ miễn dịch và đáp ứng miễn dịch của cá chẽm (Lates calcarifer) bao gồm sự phát triển hoàn thiện của tuyến ức, cơ quan lympho trung ương đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu; đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thể hiện qua hoạt tính của đại thực bào và lysozyme; và đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu khi bị hoạt hóa bởi kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae. Ý nghĩa thực tiễn: C ác kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng các biện pháp miễn dịch học nhằm phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá chẽm nuôi tại Việt Nam bao gồm việc sử dụng các chế phẩm kích ứng miễn dịch không đặc hiệu (immunostimulants) và liệu pháp vaccine, góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm tại Việt Nam theo hướng bền vững, an toàn, giảm thiểu rủi r o, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường do việc sử dụng kháng sinh và hóa chất để phòng trị bệnh cho cá. 2 Tính mới của công trình: Đây là công bố đầu tiên về hệ miễn dịch của cá chẽm và các đáp ứng miễn dịch của cá chẽm tại Việt Nam. Đồng thời, đây cũng là công bố đầu tiên trên thế giới về sự phát triển hoàn thiện của tuyến ức của cá chẽm (Lates calcarifer) được thực hiện bằng phương pháp mô học. Chương 1. TỔNG LUẬN 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM S INH HỌC VÀ TÌNH HÌNH NUÔI CÁ CHẼM Luận án đã sơ lược đặc điểm sinh học của cá chẽm, tình hình nuôi, sản lượng cá chẽm và một số bệnh thường gặp trong quá trình nuôi cá chẽm dựa vào các công bố của Lục Minh Diệp (2010), Copland và Grey (1987), Glenncross (2006), Kungvankij và cs (1984), Partridge và Lymbery (2008), Patel và cs (2009), Schipp và cs (2007), Tucker và cs (1990)… 1.2 BỆNH DO S. iniae TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Bệnh do S. iniae gây ra ở các loài cá nuôi đang có chiều hướng gia tăng và gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng t hủy sản thế giới. Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra ở cá nuôi tại các quốc gia như: Nhật, Úc, Singapore, Mỹ, Israel, Bahrain, Ấn Độ đã được tổng hợp từ các công bố của Berridge và Frelier (1998), Bromage và Owens (2002), Colorni và cs (2002), Eldar và cs (1994), Kaige và cs (1984), Kusuda và cs (1976), Minami và cs (1979), Mukhi và cs (2001), Ohnishi và Jo (1981), Pier và Madin (1976), Sugita (1996)… Các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn S. iniae, dấu hiệu bệnh lý và phương pháp phòng trị bệnh do S. iniae gây ra đã được tổng hợp từ các nghiên cứu của Bromage và Owens (2002), Colorni và cs (2002), Crosbie và Nowak (2004), Eldar và Ghittino 3 (1999), Kusuda và cs (1976), Perera và cs (1994), Park và cs (2009), Stoffregen và cs (1996)… 1.3 HỆ THỐNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƯƠNG Hệ thống miễn dịch ở cá xương được tổng hợp theo đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch thích ứng dựa theo các công bố của Blazer (1991), Greenlee và cs (1991), Hasegawa và cs (1998), Evans và Jaso-Friedmann (1992), Evans và cs (2000), Magnadottir (2006), Mulero và Meseguer (1998), Fischer và cs (2006)…Các cơ quan lympho ở cá và sự phát sinh của cơ quan lympho cũng được tổng hợp từ các nghiên cứu của Grace và Manning (1980), Botham và Manning (1981), Herraez và Zapata (1986), Ellis (1988), Bowden và cs (2005), Xie và cs (2006), Patel và cs (2009)…Các công bố đã cho thấy rằng các nghiên cứu về hệ thống miễn dịch ở cá xương xảy ra ở nhiều đối tượng nuôi và vẫn còn nhiều cơ chế đáp ứng vẫn chưa được làm rõ. Tuy vậy, nhìn chung, hệ thống miễn dịch của cá xương khá phát triển với sự hiện diện của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với nhiều chức năng tương tự như hệ miễn dịch động vật có xương sống bậc cao. Điều này cho phép cá đáp ứng tốt với việc sử dụng vaccine trong phòng bệnh. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2008 đến tháng 8/2012 tại phòng thí nghiệm Bệnh học, Trung tâm nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang và phòng thí nghiệm khoa Sinh học Trường Đại học Bergen, Nauy. 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. Cá chẽm Lates calcarifer (Bloch, 1790) kích cỡ dưới 155 gam Vi khuẩn Streptococcus iniae 4 2.3 SƠ ĐỒ KHỐI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (hình 2.1) 2.4 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH CÁC NGHIÊN CỨU 2.4.1 Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá chẽm 2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa Vi khuẩn được phân lập từ não, thận và lách của cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl và KF ở 28 o C trong 24h. Việc định danh các chủng vi khuẩn phân lập được dựa theo hệ thống định danh vi khuẩn của Bergey kết hợp so sánh trình tự 16S rDNA với ngân hàng gene có sẵn trên NCBI. FKC 2.4.1 .2 Xác định độc lực của vi khuẩn phân lập Ba chủng vi khuẩn VN091211R, CR090722P và NH081107P được lựa chọn để xác định độc lực. Thí nghiệm xác định liều gây chết 50% (LD50) của mỗi chủng vi khuẩn được tiến hành vớ i 7 nghiệm thức. Mỗi nghiệm t hức bao gồm 20 cá chẽm. Trong đó tất cả cá chẽm ở 6 nghiệm thức thí nghiệm được tiêm 0,2 mL dung dịch huyền phù 5 vào xoang bụng với mật độ vi khuẩn trong dịch huyền phù tăng dần từ 10 2 CFU/mL ở nghiệm thức 1 cho đến 10 7 CFU/mL ở nghiệm thức 6. Ở nghiệm thức đối chứng, cá được tiêm 0,2 mL PSB vào xoang bụng. Liều gây chết 50% được xác định dựa vào phân tích tỉ lệ cá chết tích lũy ở các nghiệm thức trên phần mềm probit, SPSS. 2.4.1.3 Độ nhạy kháng sinh của các chủng S. iniae phân lập Độ nhạy của các chủng vi khuẩn phân lập với các loại kháng sinh được tiến hành theo phương pháp của Bauer (1966). 2.4.1.4 Phương thức xâm nhiễm của vi khuẩn S. iniae vào cá chẽm Ngâm cá chẽm (1,3 ± 0,2g) vào dung dịch nước biển chứa vi khuẩn S. iniae VN091211R (10 7 CFU/mL) trong 1h. Sau đó nuôi cá trong nước biển sạch. Tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên 3 cá thể vào các thời điểm 6, 12, 24, 48 và 72h sau khi cho cá vào bể nuôi. Cố định các mẫu gan, thận, lách, não, mắt và ruột cá trong dung dịch Buffered Formalin 10% trong 24. Sử dụng kỹ thuật mô hóa miễn dịch để phát hiện S. iniae trong các tổ chức mô học của cá thí nghiệm. 2.4.1 .5 Tính tương đồng về kháng nguyên của các chủng phân lập Tính tương đồng về kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập được xác định bằng khả năng ngưng kết của huyết thanh cá chẽm (Plumb and Areechon 1990) sau khi được kích thích miễn dịch bằng FKC của một chủng vi khuẩn S. iniae, với chính chủng vi khuẩn đó và với các chủng S. iniae khác. 2.4.2 Đáp ứng miễn dịch của các chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với S. iniae và ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng này Thí nghiệm được tiến hành với 3 nghiệm thức (80 cá/nghiệm thức). Ở nghiệm thức 1 và 2, cá được cho ăn thức ăn viên trong khi ở nghiệm thức 3 cá được cho ăn thức ăn tương tự có bổ sung 5‰ β- 6 glucan liên tục trong 2 tuần. Sau 2 tuần nuôi, toàn bộ cá thí nghiệm ở nghiệm thức 2 và 3 được tiêm dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae bất hoạt (10 8 CFU/mL) vào xoang bụng với lượng 0,3 mL/cá. Các mẫu máu và tiền thận của ba nhóm cá thí nghiệm được thu ngay trước khi tiêm vi khuẩn bất hoạt và mỗi 12h sau khi tiêm, liên tục trong 96h. Chỉ số thực bào, hoạt tính thực bào của đại thực bào, hoạt tính lysozyme và khả năng ức chế vi khuẩn của huyết thanh cá chẽm được xác định theo phương pháp của các tác giả Crosbie và Nowak (2004), Shugar (1952). 2.4.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae bất hoạt bằng formalin (Formalin Killed Cell - FKC) i Biến động hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cá chẽm sau khi gây miễn dịch bằng FKC Thí nghiệm nghiên cứu biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu kháng S. iniae ở huyết thanh của cá chẽm được tiến hành với 2 nghiệm thức. Nghiệm thức 1 cá được tiêm dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae bất hoạt (10 8 CFU/mL) vào xoang bụng (0,3 mL/cá). Nghiệm thức 2, mỗi cá được tiêm 0,3 mL PBS vào xoang bụng. Hàm lượng kháng thể đặc hiệu kháng S. iniae trong máu cá thí nghiệm kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp theo phương pháp của Crowther (1995). ii Thành phần protein kháng nguyên của vi khuẩn S. iniae Thành phần protein kháng nguyên của vi khuẩn S. iniae được xác định bằng kỹ thuật SDS-PAGE (Laemli, 1970) và Western blot (Shoemarker và các cộng sự, 2010). iii Hiệu quả bảo vệ của FKC đối với bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm Hiệu quả bảo vệ của F KC đối với bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm được đánh giá thông qua tính an toàn đối với cá chẽm của hỗn dịch vi khuẩn bất hoạt và hệ số bảo vệ tương đối (RPP). 7 Cá chẽm (135 - 155g) được chia thành 2 nhóm: nhóm 1, cá được gây miễn dịch bằng cách tiêm FKC vào xoang bụng với liều lượng 0,3 mL/con và ở nhóm đối chứng, cá được tiêm PBS (0,3 mL/con). Cá tiêm FKC và cá đối chứng được nuôi dưỡng riêng biệt trong 2 bể composite dung tích 2 m 3 với cùng điều kiện bể nuôi (25 - 30‰, 28°C  2°C) và chế độ chăm sóc như nhau. Sau 4 tuần tất cả cá thí nghiệm được tiêm nhắc lại giống như lần tiêm đầu tiên. Việc công cường độc để xác định hiệu quả bảo vệ của vi khuẩn bất hoạt được tiến hành ở ngày thứ 60 sau khi gây miễn dịch cho cá. Thí nghiệm được tiến hành với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 30 cá chẽm v à được lặp lại 2 lần. Nghiệm thức 1: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (10 7 CFU/mL) vào xoang bụng của mỗi cá đối chứng. Nghiệm thức 2: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (10 8 CFU/mL) vào xoang bụng của mỗi cá đối chứng. Nghiệm thức 3: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (10 7 CFU/mL) vào xoang bụng của mỗi cá đã gây kích thích miễn dịch. Nghiệm thức 4: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (10 8 CFU/mL) vào xoang bụng của mỗi cá đã gây kích thích miễn dịch. Hiệu quả bảo vệ của FKC được đánh giá dựa trên hệ số bảo vệ tương đối (RPP). Giá trị RPP được tính theo công thức: Tỉ lệ chết tích lũy ở cá tiêm FKC RPP = 1 - x 100 (%) Tỉ lệ cá chết tích lũy ở cá tiêm nước muối sinh lý 2.4.5 Sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm Cá chẽm mới nở được thu mẫu từ các bể ương nuôi cá bột theo định kỳ 12h một lần cho đến khi cá đạt 40 ngày tuổi. Sử dụng phương pháp mô học để quan sát sự hình thành và phát triển của tuyến ức tương ứng với tuổi cá. 8 [...]... Điều đó cho thấy trong 4 chủng S iniae đã chọn, vi c sử dụng vi khuẩn S iniae VN091211R làm nguyên liệu để sản xuất bacterin là lựa chọn tốt nhất 3.2 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM ĐỐI VỚI VI KHUẨN S iniae 3.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S iniae và ảnh hưởng của β-glucan đến đáp ứng này 3.2.1.1 Hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào Vi c tiêm FKC làm sự gia tăng hoạt... từ cá chẽm sau khi được gây miễn dịch bởi FKC của vi khuẩn VN091211R và NT090612C có khả năng ngưng kết với chính chủng vi khuẩn nguyên liệu cao hơn so với hai chủng còn lại Tuy nhiên, khả năng ngưng kết chéo của huyết thanh thu được từ các cá chẽm được gây miễn dịch bằng FKC của vi khuẩn VN091211R đối với các vi khuẩn khác cao hơn so với huyết thanh thu từ cá chẽm được kích thích bằng FKC của vi khuẩn. .. liệu Các số liệu thu thập từ các thí nghiệm được xử lý thống kê dựa trên phần mềm SPSS 19.0 và microsoft excel 2003 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus iniae PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM 3.1.1 Phân lập vi khuẩn S iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 3.1.1.1 Tình hình dịch bệnh do S iniae gây ra ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa Kết quả phân tích 104 đàn cá chẽm. .. cao hơn so với cá đối chứng (hình 3.12) β-glucan cũng làm nâng cao tác dụng của FKC trong vi c làm gia tăng nồng độ lysozyme trong huyết thanh của cá thí nghiệm 3.2.1.3 Khả năng ức chế vi khuẩn S iniae của huyết thanh cá chẽm 12 giờ sau khi tiêm FKC, huyết thanh cá chẽm thí nghiệm có khả năng ức chế thêm 26,8% vi khuẩn S iniae so với cá đối chứng Tỉ lệ vi khuẩn bị ức chế bởi huyết thanh cá chẽm tăng... lệ vi khuẩn bị ức chế bởi huyết thanh cá chẽm khi tiêm vi khuẩn bất hoạt cao hơn rõ rệt (P . tại Khánh Hòa 2. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 4. Đánh giá hiệu quả của vi c sử. chính chủng vi khuẩn đó và với các chủng S. iniae khác. 2.4.2 Đáp ứng miễn dịch của các chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với S. iniae và. nhất. 3.2 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM ĐỐI VỚI VI KHUẨN S. iniae 3.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae và ảnh hưởng của β-glucan đến đáp ứng này 3.2.1.1