Nghiên cứu chiết tách và xác định hợp chất wedelolactone từ cây cỏ mực ở đà nẵng

MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ xƣa đến nay, việc sử dụng các cây cỏ làm thuốc quý đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống con ngƣời. Ngày nay với nền kinh tế phát triển mạnh mẽ, mục tiêu sức khỏe con ngƣời ngày càng đƣợc đề cao nên việc phân lập những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ cây cỏ là một việc rất quan trọng. Nó đƣợc ứng dụng sản thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghệp thực phẩm và mỹ phẩm. Nƣớc ta là nƣớc có khí hậu nhiệt đới gió mùa, đây là điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của các cây dƣợc liệu quý. Theo các số liệu thống kê mới nhất, thảm thực vật Việt Nam – nguồn tài nguyên sinh học quý giá – có trên 12000 loài, trong số đó có tới hơn 3200 loài đƣợc sử dụng làm thuốc hay thực phẩm chức năng trong y học dân gian. Đây là một lợi thế to lớn đối với ngành công nghiệp hóa dƣợc nƣớc ta. Cây Cỏ mực đƣợc sử dụng nhiều trong các bài thuốc dân gian. Nó là một loài cỏ mọc hoang ở khắp nơi nhƣ Ấn Độ, Pakistan, Việt Nam, Trung Quốc và các quốc gia vùng Nam Á. Cỏ mực là một cây thuốc nam tốt chữa trị xuất huyết nội tạng nhƣ: ho ra máu, xuất huyết ruột, chảy máu răng, nƣớu, lợi, trị sƣng gan, sƣng bàng quang, sƣng đƣờng tiểu, trị mụn nhọt đầu đinh, bó ngoài giúp liền xƣơng. Cỏ mực gồm nhiều thành phần hóa học nhƣ dẫn chất thiophen, terthienyl aldehyd ecliptal, wedelolacton, stigmasterol, sitosterol, glucosid khung olean, tinh dầu, chất đắng, alkaloid (Nicotin, Ecliptin). Trong đó, hợp chất đƣợc biết đến nhiều nhất trong Cỏ mực là Wedelolactone. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học ở các nƣớc Châu Á, hợp chất wedelolacton có khả năng trị độc do rắn cắn và kháng khuẩn. Việc nghiên cứu về những mặt tác dụng sinh học của hợp chất wedelolactone nói riêng và cây Cỏ mực nói chung rất phổ biến ở các nƣớc ngoài đặc biệt là Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan … Nhƣng ở Việt Nam có rất công trình nghiên cứu về loại cây này. Để góp phần nghiên cứu về cây cỏ mực ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới em đã quyết định chọn đề tài : ― NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT WEDELOLACTONE TỪ CÂY CỎ MỰC Ở ĐÀ NẴNG ‖

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA -   -

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ

XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT WEDELOLACTONE TỪ CÂY CỎ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA HÓA

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên : NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

Lớp : 08CHD

1 Tên đề tài : “ Nghiên cứu chiết tách và xác định hợp chất Wedelolactone từ cây

cỏ mực ở Đà Nẵng”

2 Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị

Nguyên liệu : Cây cỏ mực

Dụng cụ, thiết bị :

 Máy đo điểm chảy (melting point) Buchi B450

 Các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY được ghi trên máy

đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR SPECTROMETER) Model DRX500 (tần số

500 MHz) BRUCKER AVANCE

 Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng RSLC Ultimax 3000, Pump Ultimax RS3000 DLP 3600 Autosampler Ultimax RS3000, Ovencolumn Ultimax RS3000, Detector DAD RS3000 , Phần mềm điều khiển hệ thống RSLC Chromelion 7.0

 Cột sắc ký phân tích Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm, hãng Dionex

 Cột sắc ký điều chế pha thuận Inox 25 x 300 mm, cột sắc ký điều chế pha thuận thủy tinh 15 x 450 mm Hạt nhồi pha thuận silicagel cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm Merck

 Bơm sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC10A, Japan, tốc độ dòng max 10 ml/phút

 Sắc ký bản mỏng (TLC): Silicagel GF 60F254 Merck

 Đèn soi bản mỏng bước sóng 254 nm và 365 nm

 Bể lắc siêu âm Elmasonic S 100 H

 Tủ sấy Binder khoảng nhiệt độ 30-280o

C, lò nung Nabertherm Model b150 khoảng nhiệt độ nung 30-1100o

C

3 Nội dung nghiên cứu :

 Xác định độ ẩm của cây cỏ mực

 Xác định hàm lượng tro của cây cỏ mực khô

 Xác định hàm lượng một số kim loại nặng trong cây cỏ mực khô

 Khảo sát các điều kiện chiết tối ưu

 Phân lập và tinh chế hợp chất wedelolactone

 Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

Wedelolactone trong cây cỏ mực

4 Giáo viên hướng dẫn : Gs.Ts ĐÀO HÙNG CƯỜNG

5 Ngày giao đề tài :

6 Ngày hoàn thành :

Sinh viên đã hoàn thành và nộp khóa luận cho khoa ngày… tháng … năm …

Kết quả điểm đánh giá :………

Đà nẵng, ngày… tháng … năm … CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

MỤC LỤC

Trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Đại cương về cỏ mực 1

1.1.1 Đặc điểm cây cỏ mực 1

1.1.2 Phân bố và sinh thái 4

1.1.3 Tác dụng dược lý của cỏ mực 4

1.1.3.1 Y học dân gian 4

1.1.3.2 Y học và hóa sinh hiện đại 13

1.2 Một số công trình nghiên cứu về cây cỏ mực 15

1.2.1 Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam 15

1.2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới 16

1.2.2.1 Thành phần hóa học của Cỏ mực 16

1.2.2.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học 17

1.2.2.3 Các hợp chất tiêu biểu đã được cô lập từ Cỏ mực 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Thiết bị và hóa chất 30

2.2 Nguyên liệu 31

2.2.1 Thu hái nguyên liệu 31

2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Xác định độ ẩm 31

2.3.2 Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu 32

2.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) 32

2.3.4 Phương pháp phổ hấp thu nguyên tử (AAS) 33

2.3.5 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 34

2.3.6 Khảo sát thành phần các chất chiết được trong một số loại dung môi, điều chế cao thô và phân lập, tinh chế các chất từ cao thô, xác định thành phần và cấu tạo

chất tinh chế 36

2.3.6.1 Khảo sát sơ bộ thành phần các chất chiết được trong các loại dung môi 36

2.3.6.2 Điều chế cao thô 36

2.3.6.3 Phân lập và tinh chế các chất từ cao EPE 37

2.3.6.4 Xác định thành phần và cấu tạo chất tinh chế 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1.Sơ đồ nghiên cứu 38

3.1.1 Sơ đồ khảo sát điều kiện chiết xuất 38

3.1.2 Sơ đồ phân lập, tinh chế các chất tinh khiết 39

3.2 Xử lý nguyên liệu 40

3.2.1 Thu hái nguyên liệu 40

3.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu 40

3.3 Xác đỊnh các chỈ tiêu 40

3.3.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 40

3.3.2 Xác định hàm lượng tro 41

3.3.3 Xác định hàm lượng kim loại nặng 42

3.4 Khảo sát thành phàn các chất chiết được trong các dung môi 43

3.4.1 Mục tiêu 43

3.4.2 Phương pháp chiết 43

3.4.3 Tiến hành 43

3.4.4 Kết quả 44

3.5 Khảo sát tỷ lệ dung môi và khối lượng mẫu chiết 45

3.5.1 Mục tiêu 45

3.5.2 Tiến hành 45

3.5.3 Kết quả 46

3.6 Khảo sát thời gian chiết 47

3.6.1 Mục tiêu 47

3.6.2 Tiến hành 48

3.6.3 Kết quả 48

3.7 Chiết xuất, phân lập, tinh chế Wedelolactone 50

3.7.1 Mục tiêu 50

3.7.2 Thiết bị, dụng cụ, máy, hóa chất 50

3.7.3 Chiết xuất cao phân đoạn Ethyl acetat 51

3.7.4 Phân lập, tinh chế wedelolactone trong phân đoạn cao Ethyl Acetat 52

3.7.4.1 Phân lập trên cột sắc kí điều chế pha thuận 52

3.8 Xác định các đặc trƣng vật lý, định danh cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc 54

3.8.1 Chất EPE1 54

3.8.1.1 Các đặc tính của EPPE1 54

3.8.1.2 Nhận danh cấu trúc EPE1 56

KẾT LUẬN 60

KIẾN NGHỊ 61

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Từ xưa đến nay, việc sử dụng các cây cỏ làm thuốc quý đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống con người Ngày nay với nền kinh tế phát triển mạnh mẽ, mục tiêu sức khỏe con người ngày càng được đề cao nên việc phân lập những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ cây cỏ là một việc rất quan trọng Nó được ứng dụng sản thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghệp thực phẩm và mỹ phẩm

Nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, đây là điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của các cây dược liệu quý Theo các số liệu thống kê mới nhất, thảm thực vật Việt Nam – nguồn tài nguyên sinh học quý giá – có trên 12000 loài, trong số đó có tới hơn 3200 loài được sử dụng làm thuốc hay thực phẩm chức năng trong y học dân gian Đây là một lợi thế to lớn đối với ngành công nghiệp hóa dược nước ta

Cây Cỏ mực được sử dụng nhiều trong các bài thuốc dân gian Nó là một loài cỏ mọc hoang ở khắp nơi như Ấn Độ, Pakistan, Việt Nam, Trung Quốc và các quốc gia vùng Nam Á Cỏ mực là một cây thuốc nam tốt chữa trị xuất huyết nội tạng như: ho ra máu, xuất huyết ruột, chảy máu răng, nướu, lợi, trị sưng gan, sưng bàng quang, sưng đường tiểu, trị mụn nhọt đầu đinh, bó ngoài giúp liền xương Cỏ mực gồm nhiều thành phần hóa học như dẫn chất thiophen, terthienyl aldehyd ecliptal, wedelolacton, stigmasterol, sitosterol, glucosid khung olean, tinh dầu, chất đắng, alkaloid (Nicotin, Ecliptin) Trong đó, hợp chất được biết đến nhiều nhất trong Cỏ mực là Wedelolactone Theo nghiên cứu của các nhà khoa học ở các nước Châu Á, hợp chất wedelolacton có khả năng trị độc do rắn cắn và kháng khuẩn

Việc nghiên cứu về những mặt tác dụng sinh học của hợp chất wedelolactone nói riêng và cây Cỏ mực nói chung rất phổ biến ở các nước ngoài đặc biệt là Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan … Nhưng ở Việt Nam có rất công trình nghiên cứu về loại cây này Để góp phần nghiên cứu về cây cỏ mực ở Việt Nam cũng như

trên thế giới em đã quyết định chọn đề tài : ― NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ

XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT WEDELOLACTONE TỪ CÂY CỎ MỰC Ở ĐÀ NẴNG ‖

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng qui trình chiết tách hợp chất wedelolactone

- Xác định cấu trúc của hợp chất wedelolactone

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu

Cây Cỏ mực được thu hái ở Phố Đà nẵng

* Phạm vi nghiên cứu

- Phần trên mặt đất của cây cỏ mực

- Chiết tách, xác định hợp chất wedelolactone trong cây cỏ mực

4 Phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu lý thuyết: phương pháp tổng quan tài liệu về các tài liệu về đặc điểm

hình thái thực vật, thành phần hóa học, ứng dụng của cây Cỏ mực

- Phương pháp thực nghiệm:

 Phương pháp lấy mẫu, thu hái và xử lí mẫu

 Phương pháp phân tích trọng lượng để xác định độ ẩm trong nguyên liệu tươi

 Áp dụng phương pháp phân huỷ mẫu phân tích để khảo sát hàm lượng tro

 Phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử (AAS) để xác định hàm lượng các kim loại nặng trong cây Cỏ mực

 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định ảnh hưởng của các yếu tố như dung môi, tỉ lệ rắn lỏng, thời gian chiết

 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất wedelolactone có trong cây Cỏ mực

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

6 BỐ CỤC LUẬN VĂN : Gồm 3 phần

PHẦN MỞ ĐẦU

1- Lý do chọn đề tài

2- Mục tiêu nghiên cứu

3- Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4- Phương pháp nghiên cứu

5- Nội dung nghiên cứu

6- Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

7- Bố cục luận văn

PHẦN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Chương 1- Tổng quan lý thuyết

Chương 2- Thực nghiệm

Chương 3 – Kết quả và thảo luận

PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CỎ MỰC

1.1.1 Đặc điểm cây cỏ mực [1], [3], [ 5], [ 10], [ 11]

Tên khoa học: Eclipta prostrata (L.) [Eclipta alba (L) Hassk.]

Tên khác: Cỏ nhọ nồi, cỏ mực, hạn liên thảo, lệ trường, phong trường, mạy

mỏ lắc nà (Tày), nhả cha chát (Thái)

Tên nước ngoài: Dyer’s weed, dye-weed, white eclipta (Anh), éclipta driote (Pháp)

Hình 1.2: Thân cây cỏ mực

Lá nguyên, mọc đối, hình mũi mác, màu xám đen và nhăn nheo, dài 2,5-5

cm Hai mặt lá đều có lông cứng ngắn, màu trắng Mép phiến lá có răng cưa to và nông Gốc phiến lá men xuống nên trông như không có cuống lá

Hình 1.3: Lá cỏ mực

Cụm hoa hình đầu, màu trắng, đường kính 4-8 cm, mọc ở kẽ lá hay ngọn cành Đầu mang hai loại hoa: hoa cái hình lưỡi nhỏ ở ngoài, hoa lưỡng tính hình ống ở trong,

có khi các hoa đã rụng, chỉ còn lại bao hoa và trục cụm hoa Cây ra hoa từ tháng 7 đến tháng 9

1.1.2 Phân bố và sinh thái [3]

Chi Eclipta L chỉ có một loài là cây Cỏ mực mọc tập trung nhiều ở hầu hết

các nước vùng Nam và Đông Nam châu Á

Ở Việt Nam, Cỏ mực phân bố rộng rãi ở khắp các tỉnh vùng đồng bằng, trung du và miền núi đến độ cao 1500 m (ở các tỉnh phía nam) Cây ưa ẩm, ưa sáng

và có thể chịu bóng râm, thường mọc lẫn với các loại cỏ thấp, trên đất ẩm ở bãi sông, ruộng trồng hoa màu, ven đường đi, bãi hoang quanh làng bản Ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên bằng hạt Bên cạnh đó với khả năng mọc chồi gốc

và phân cành nhiều, cây dễ dàng phát triển, tạo thành đám bò lan trên mặt đất

Ngoài việc thu hái từ nguồn hoang dại, trước đây Cỏ mực chỉ được trồng lẻ

tẻ với quy mô ở các gia đình Gần đây, cây đã bắt đầu được trồng phổ biến hơn ở một số nơi Cỏ mực được nhân giống bằng hạt Hạt Cỏ mực rất nhỏ nhưng tỷ lệ nảy mầm cao Thường áp dụng cách gieo hạt trong vườn ươm, sau đó đánh cây con đem trồng Đất vườn ươm và đất trồng cần làm thật tơi nhỏ Nên bón phân lót (10-15 tấn phân chuồng/ha), lên luống như luống cải rồi trồng với khoảng cách 2020 cm hay

2015 cm Sau khi cây bén rễ, có thể dùng nước phân, nước giải hoặc đạm pha loãng định kỳ cách 20 ngày tưới thúc một lần

Cỏ mực không có sâu bệnh, nhưng cần chú ý làm cỏ và giữ ẩm Cây có thể trồng được trong điều kiện che bóng một phần

1.1.3 Tác dụng dược lý của cỏ mực [3]

1.1.3.1 Y học dân gian

a Y học dân gian Việt Nam

Cỏ mực có vị chua, mặn, tính mát có tác dụng bổ thận, mạnh xương, đen tóc, mát huyết, cầm máu, giải độc

Cỏ mực thường được dùng làm thuốc bổ máu, cầm mấu bên trong và bên ngoài, chữa ho ra máu, rong kinh, rong huyết, băng kinh, băng huyết, chảy máu cam, trĩ ra máu, nôn ra máu, đái ra máu, bị thương chảy máu, viêm gan mạn, mẫn ngứa (uống trong, rửa ngoài) Ngoài ra, Cỏ mực còn dùng chữa ban sởi, ho, hen, viêm họng, bỏng, lao phổi, di mộng tinh, bệnh nấm ở da, làm thuốc mọc tóc (sắc uống hoặc ngâm vào dầu dừa mà bôi) và nhuộm tóc,…

Cách sử dụng, có thể sử dụng dưới 2 dạng sau: Cỏ mực tươi (cả thân và lá), lấy khoảng 30-50 g rửa sạch, giã nhỏ, vắt lấy nước uống 2-3 lần/ngày Cỏ mực khô: lấy chừng 20 g sắc với 150 mL nước (còn lại 50 mL) uống 1 lần, mỗi ngày 2-3 lần

Cỏ mực được dùng ngoài làm thuốc sát trùng chữa các vết thương và vết loét

4 Tiểu ra máu Cỏ mực, mã đề 2 vị bằng nhau,

gừng

Giã lấy nước ngày uống

3 chén lúc đói Hoặc nấu cháo Cỏ mực (100 g) với

3 lát gừng

5 Trĩ ra máu Một nắm Cỏ mực để nguyên rễ Giã nhuyễn, cho vào 1

chén rượu nóng, thành dịch đặc vừa uống trong, vừa đắp bã ngoài

6 Chảy máu dạ

dày-hành tá

tràng

Cỏ mực 50 g, bạch cập 25 g, đại táo 4 quả, cam thảo 15 g

Sắc uống, ngày 1 thang chia làm 2 lần

Lấy 1-2 thìa canh hòa nước đun sôi còn ấm hoặc cho ít rượu gạo để uống Ngày 2 lần, cao này có tác dụng bổ thận, ích tinh huyết

b sắc lấy nước, bỏ bã, uống thay nước trà hàng ngày Mỗi ngày 1 tễ; liên tục 30 ngày

c sắc lấy nước, mỗi ngày 1 tễ; liên tục 30 ngày

10 Chữa ho ra máu Cỏ mực 25 g, bạch cập 20 g, a

giao 10 g

Cỏ mực và bạch cập sắc lấy nước, cho a giao vào trộn đều Mỗi ngày 1 tễ, chia ra 2 lần trong ngày; liên tục trong 7 ngày

11 Chữa sỏi thận, Cỏ mực 15 g, cỏ mã đề (xa tiền Cỏ mực và mã đề sắc lấy

tiểu tiện ra máu thảo) 15 g, đường trắng vừa đủ

ngọt Đem

nước; khi uống thêm đường đủ ngọt Mỗi ngày 1 tễ, uống thay trà trong ngày; liên tục trong 20 ngày

12 Mũi thường

chảy máu

Cỏ mực 25 g, ngó sen 20 g Sắc lấy nước; chia 2 lần

vào sáng và chiều; liên tục trong 20 ngày

Nhân sâm thái thành lát mỏng, hấp chín Cỏ mực sắc lấy nước để nấu cháo Cháo chín, cho sâm vào, thêm đường đủ ngọt Mỗi ngày 1 lần, ăn thay bữa sáng; liên tục trong 5 ngày

15 Phụ nữ ngứa âm

đạo

Cỏ mực tươi khoảng 100 g Sắc nước để rửa ngoài

âm đạo Có thể thêm chút câu đằng vào sắc cùng càng tốt

16 Thuốc cầm máu a 12 g Cỏ mực khô hoặc 30-50

g tươi

b Cao lỏng Cỏ mực (1/1) một phần, bột mịn lá cóc kèn 2

a Sắc uống Dùng riêng hoặc phối hợp với ngó sen, lá trắc bá, bách hợp

b Ngày uống 3 lần, mỗi

phần, tá dược vừa đủ làm viên nén 200 mg

lần 5 g

17 Chữa lỵ a Cỏ mực 10 g, rau sam 10 g,

cỏ sữa lá to 10 g, lá nhót 10 g, búp ổi 10 g

b Cỏ mực tươi 100 g, lá mơ tươi (mơ tam thể hay mơ trắng)

80 g, lá đại thanh tươi 30 g, hạt cau 6 g, bách bộ 12 g, vỏ đại 8

g

c Cỏ mực tươi 100 g, lá mơ long (mơ trắng, mơ dại) 100 g

a Dạng thuốc bột, thuốc hoàn, ngày uống 2-3 lần, mỗi lần 10 g

b Sắc đặc chia nhiều lần uống trong ngày Có tác dụng với cả lỵ amip và trực khuẩn

c Sắc đặc chia nhiều lần uống trong ngày

18 Chữa tiêu chảy

(do nhiễm

khuẩn đường

tiêu hóa)

Cỏ mực một nắm, mã đề tươi 1-2 nắm, rau má 1 nắm

Sắc đặc chia nhiều lần uống trong ngày

Sắc uống

20 Chữa sốt xuất

huyết

a Cỏ mực tươi 30 g, rau má tươi (hoặc cát căn, cỏ mần trầu)

30 g, bông mã đề tươi (hoặc cối xay, rễ cỏ tranh) 20 g

b Cỏ mực tươi, rau má tươi (hoặc cát căn), rau sam tươi,

mã đề tươi mỗi vị 40 g, kim ngân tươi 30 g, hoa hòe 10 g, thảo quyết minh

a Vắt lấy nước uống hoặc sắc uống Bài thuốc này cũng có thể dùng để phòng bệnh

b Sắc với 300 mL nước lấy 100 mL uống nước đầu Sau đó sắc nước thứ hai và thứ ba uống tiếp trong ngày

Giã nát, thêm nước, vắt lấy nước uống, bã dùng xoa, đắp chỗ sưng

22 Chữa trẻ em tưa

lưỡi

Cỏ mực tươi 4 g, hẹ 2 g Giã nhỏ, vắt lấy nước

cốt, hòa mật ong, trộn đều, chấm thuốc vào lưỡi, cách 2 giờ một lần

23 Chữa rong kinh,

rong huyết sau

khi đặt dụng cụ

tử cung

Cỏ mực 16 g, sinh địa 16 g, hoài sơn 16 g, đương quy 12 g, bạch thược 12 g, thỏ tỵ tử 12 g, ích mẫu 12 g, hương phụ 12 g, xuyên khung 8 g

Cỏ mực tươi 30 g, rau má tươi

30 g, sinh địa 16 g, ích mẫu 16

g, củ gấu (tử chế) 12 g, quả dành dành (sao cháy) 12 g, ngưu tất 12 g

Sắc uống ngày một thang

25 Chữa động thai

băng huyết

Cỏ mực một nắm, ngải cứu một nắm, trắc bá diệp một nắm sao cháy đen, cành tía tô 12 g (hoặc nhọ chảo, nhọ soong 10 g), củ gai 12 g

Sắc đặc uống làm một lần

26 Ho do viêm

họng hoặc viêm

amidam cấp

Cỏ mực tươi 50 g Sắc uống mỗi ngày 1

thang, trong 3 ngày

10 ngày liền

a Uống mỗi lần 8 g với nước cơm, hay sắc 30 g uống

b Sắc uống ngày một thang

29 Chữa chảy máu

kéo dài do

nguyên nhân

bệnh

Cỏ mực, đảng sâm, ô tặc cốt, mỗi vị 16 g; hoàng kỳ, bạch truật, địa du, ngải cứu, trắc bá dịp, mỗi vị 12 g; đương quy 8 g; cam thảo 6 g

Sắc uống ngày một thang

12 g; tri mẫu, chi tử sao đen, mỗi vị 8 g

Sắc uống ngày một thang

31 Chữa rong kinh a Do thừa foliculin: Cỏ mực 20

g; đảng sâm, ý dĩ, hoài sơn, mỗi vị 16 g; bạch truật 12 g;

huyết dụ 6 g

b Do nhiễm khuẩn đường sinh dục (huyết nhiệt): Cỏ mực 20 g; sinh địa, huyền sâm, mỗi vị

16 g; địa cốt bì, rễ cỏ tranh, mỗi vị 12 g; huyết dụ 6 g

Sắc uống ngày một thang

32 Chữa rong

huyết

a Cỏ mực, sinh địa, mỗi vị 16

g, huyền sâm 12 g, địa cốt bì,

kỷ tử, a giao, than bẹ móc, chi

Sắc uống ngày một thang

33 Chữa phong tê

34 Chữa lao phổi Cỏ mực 12 g; đảng sâm 16 g;

bạch truật, tử uyển, mỗi vị 12 g; phục linh, bách hợp, mỗi vị 8 g; cam thảo, ngũ vị tử, bối mẫu, mỗi vị 16 g

Sắc uống ngày một thang

35 Chữa thiếu máu

do thiểu năng

tạo máu của tủy

xương

Cỏ mực, thục địa, mỗi vị 16 g;

hoài sơn, mai ba ba, ngẫu tiết,

rễ cỏ tranh, mỗi vị 12 g; sơn thù, trạch tả, phục linh, đan bì, mỗi vị 8 g

Sắc uống ngày một thang

36 Chữa viêm gan

virus thể mạn

tính tiến triển

Cỏ mực 12 g; mẫu lệ 16 g; kê huyết đẳng, sinh địa, mỗi vị 12 g; quy bản 10 g; uất kim, tam lăng, nga truật, chỉ xác, mỗi vị

8 g

Sắc uống ngày một thang

37 Chữa đái ra Cỏ mực, đảng sâm, mỗi vị 16 Sắc uống ngày một

máu kéo dài do

bệnh toàn thân

g; hoài sơn, bạch truật, thạch hộc, ngẫu tiết sao đen, thục địa, trắc bá diệp, ngải cứu, mỗi vị

12 g

thang

b Y học dân gian thế giới

Cỏ mực đã được dùng phổ biến trong dân gian tại Ấn Độ, Pakistan, Trung Quốc và các quốc gia vùng Nam Á

1 - Tại Ấn Độ:

Cỏ mực được dùng làm thuốc bổ và chữa ứ tắc trong các bệnh phì đại gan và

lá lách, và một số bệnh về da, nấm lác đồng tiền Một chế phẩm làm từ dịch ép lá cỏ mực đun nóng với dầu dừa hoặc dầu vừng được dùng để bôi đầu làm tóc dầy và đen Cây cũng được dùng trị ho, chảy máu miệng, ăn khó tiêu, choáng váng, chữa đau răng, giúp lành vết thương Rễ dùng gây nôn mửa, xổ Lá giã nát đắp trị vết cắn

do bò cạp

2 - Tại Pakistan:

Eclipta alba, được gọi tại Pakistan là Bhangra, Bhringaraja, được dùng trong

dân gian dưới nhiều dạng Cây tươi được dùng làm thuốc bổ chung, giúp giảm sưng gan và lá lách, trị bệnh ngoài da, trị suyễn, khi dùng trị bệnh gan liều nước sắc sử dụng là một thìa cà phê hai lần mỗi ngày; cây giã nát, trộn với dầu mè được dùng để đắp vào nơi hạch sưng, trị bệnh ngoài da Lá dùng trị ho, nhức đầu, hói tóc, gan và

lá lách sưng phù, vàng da

3 - Tại Trung Hoa:

Eclipta prostrata, hay Mò hàn lian: Lá được cho là giúp mọc tóc Toàn cây

là chất chát cầm máu, trị đau mắt, ho ra máu, tiểu ra máu; đau lưng, sưng ruột, sưng gan, vàng da Lá tươi được cho là có thể bảo vệ chân và tay nông gia chống lại sưng

và nhiễm độc khi làm việc đồng áng, tác dụng này theo Viện Y học Chiangsu là do

ở thiophene trong cây

1.1.3.2 Y học và hóa sinh hiện đại

Cỏ mực có tác dụng cầm máu do làm tăng tổng lượng prothrombin trong máu, giống như cơ chế tác dụng của vitamin K Hoạt tính cầm máu của 1 g bột Cỏ mực khô tương đương 1,33 mg vitamin K

Khi dùng vài ngày, có tác dụng chống choáng phản vệ, kháng histamin và giảm viêm Khác với các thuốc kháng histamin tổng hợp, Cỏ mực không kháng được tác dụng của histamin liều cao, gây choáng và chết

Có tác dụng ức chế các chủng vi khuẩn: liên cầu, tụ cầu khuẩn vàng, trực

khuẩn bạch hầu, Bacillus anthracis, Bacillus subtilis

Có độc tính rất thấp, có giới hạn an toàn rộng

Các chế phẩm siro và viên nén bào chế từ cao Cỏ mực đã được áp dụng cho

500 bệnh nhân và theo dõi kết quả điều trị tại bệnh viện và nhà hộ sinh cho thấy các tác dụng sau:

Cầm máu tốt và trong vài trường hợp cá biệt, tác dụng này của Cỏ mực thể hiện rõ rệt hơn cả tác dụng của vitamin K

Nâng cao tổng hợp lượng prothrombin trong máu rõ rệt trong trường hợp suy gan

Chống viêm nhiễm trong các trường hợp cảm sốt, cúm, nhiễm khuẩn đường hô hấp thể cấp tính nhẹ và trung bình, mụn nhọt, viêm cơ

Để phòng nhiễm khuẩn sau khi mổ ổ bụng, mổ cắt ruột thừa, đặt vòng, nạo thai

Chóng làm lành các vết cắt, vết mổ trong các phẫu thuật, làm đóng giả mạc sớm và tốt trong các trường hợp cắt amiđan, làm chóng khô và không tụ máu ở các vết mổ ở bụng

Không có biểu hiện độc khi dùng liều hàng ngày 40-100 g tươi trong 15 ngày liền

Cao lỏng lá Cỏ mực đã được áp dụng để điều trị 70 bệnh nhân bị viêm âm đạo

(23 người do tạp khuẩn, 26 người do nấm và 21 người do Trichomonas) Trước khi

áp dụng thuốc, thụt âm đạo bằng nước chín Sau đó tẩm cao lỏng lá Cỏ mực vào một bấc, bôi khắp diện âm đạo Sau 6-8 giờ, bệnh nhân tự rút bấc ra Tỷ lệ bệnh

nhân khỏi và đỡ đối với viêm âm đạo do tạp khuẩn: 86,3, đối với nấm: 73, đối

với Trichomonas: 61,9

Bài thuốc có Cỏ mực và 7 thuốc khác đã được áp dụng để điều trị viêm âm đạo

do Trichomonas thể hư chứng, phối hợp với một bài thuốc khác dùng ngoài Kết

quả điều trị trên 68 bệnh nhân: khỏi 80,8, đỡ 11,7

Trên lâm sàng, đã dùng cao cầm máu bào chế từ Cỏ mực và 4 dược liệu khác thay hoàn toàn nước oxy già trong 697 ca cắt amiđan, 3.162 ca nạo VA (sùi vòm họng) và 417 ca nhổ răng, không có tai biến nào

Chế phẩm bào chế từ 3 dược liệu: Cỏ mực, huyền sâm, sài đất đã được áp dụng để điều trị các bệnh cao huyết áp, chế phẩm này đã có tác dụng như sau: an thần ở 66,66 bệnh nhân; lợi tiểu (tăng lượng nước tiểu 300-400 mL/ngày) ở 63,88 bệnh nhân, thuốc không gây phản ứng phụ khi dùng điều trị lâu dài

Bài thuốc trong có Cỏ mực và 8 dược liệu khác đã được áp dụng để điều trị sỏi niệu quản đái ra máu nhiều Có 51 ca trong tổng số 89 bệnh nhân được điều trị đạt kết quả tốt (57,3) và 15 ca có tiến bộ (16,8)

Ngoài ra Cỏ mực còn có khả năng trung hòa tác dụng của nọc rắn: nghiên cứu tại Đại học Universidade Federal do Rio de Janeiro (Brasil) (1989) ghi nhận dịch

chiết bằng EtOH của Eclipta alba có khả năng trung hòa các hoạt tính nguy hại (đến gây chết người) của nọc độc loài rắn chuông Nam Mỹ (Crotalus durissus terrificus) Các mẫu dịch chiết tương đương với 1,8 mg trích tinh khô dùng cho mỗi

chuột thử có thể trung hòa được đến 4 liều nọc độc gây tử vong

1.2 MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CỎ MỰC

1.2.1 Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam

Mặc dù Cỏ mực là một dược thảo được biết đến từ rất lâu tại Việt Nam nhưng cho đến nay có rất ít công trình nghiên cứu về nó

Hiện nay chưa xác định được hết các hợp chất có trong cây Cỏ mực Thành phần chính của cây Cỏ mực là các triterpene, saponin, flavonoid và các dẫn xuất của coumestan

Hợp chất được biết đến nhiều nhất trong Cỏ mực là Wedelolactone Các dẫn xuất của Wedelolactone như Demethylwedelolactone, Isodemethylwedelolactone…

đã được phân lập

Một nghiên cứu của nhóm tác giả Đỗ Quỳnh Như về tác dụng của Cỏ mực đối với bệnh loét niêm mạc miệng cho thấy, Cỏ mực có tác dụng chống viêm Hoạt tính chống viêm của Cỏ mực tương đương với Pyralvex sau 15 phút sử dụng Tuy nhiên, khả năng làm lành vết loét của Cỏ mực không nhanh hơn diễn tiến tự nhiên không dùng thuốc [4]

Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Diễm Hồng đã thăm dò tác dụng của cao cồn và cao nước của Cỏ mực trên đường huyết và đưa đến kết quả là cao chiết cồn 45 của Cỏ mực có tác dụng làm hạ đường huyết trên mô hình gây quá tải glucose, với thời gian có tác dụng là 90 phút sau khi uống và liều có tác dụng là 0,5g/kg thể trọng [9]

Về thành phần hóa học, các tác giả ở Việt Nam như Nguyễn Thị Việt Thanh,

Nguyễn Văn Đậu đã cô lập ba chất là Luteolin, Wedelolactone và Desmethylwedelolactone và khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa và độc tính tế bào Kết quả cho thấy các chất do nhóm tác giả này phân lập được đều không có hoạt tính hoặc hoạt tính yếu [12]

Võ Thanh Thúy cũng đã cô lập được một số chất từ cây

lô không xử lý)

1.2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới

1.2.2.1 Thành phần hóa học của Cỏ mực [3],[47], [64], [70], [83] , [88]

 Các glycoside triterpene và saponon: 13 glycoside loại oleanane:

Eclalbasaponin IXIII, Echinocystic acid, -amyrin và -amyrin, Eclalbatin, Ecliptasaponin B, C, D

 Các Flavonoid: Lá và đọt lá chứa Apigenin, Luteolin, và các dẫn xuất glycoside

Toàn cây chứa các chất nhƣ Wedelolactone, Desmethylwedelolactone, Isodemethylwedelolactone, Quercetin, Orobol

 Sesquiterpene lactone: Columbin

 Các sterols nhƣ: -sitosterol, Stigmasterol và dẫn xuất glycoside là Stigmasterol-3-O-glycoside

 Các dẫn xuất của Thiophene:

-terthienyl; Ecliptal (-terthienyl aldehyde, -formyl--terthienyl); L-terthienyl methanol (-terthienyl-methanol);

2-(buta-1,3-diynyl)-5-but-(3-en-1-ynyl) thiophene;

2-(buta-1,3-diynyl)-5-but-(4cloro-3-hydroxybut-1-ynyl) thiophene;

5-(3-buten-1-ynyl)-2,2-bithienyl-5-methyl acetate;

5-hydroxymethyl-(2,2:5,2)-terthienyl tiglate;

5-hydroxymethyl-(2,2:5,2)-terthienyl angelate;

5-hydroxymethyl-(2,2:5,2)-terthienyl acetate;

Ecliptalbine [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3, 23-diol];

(20R)-4-hydroxyverazine; 4-hydroxyverazine; (20R)-25-hydroxyverazine;

25-hydroxyverazine

 Các rượu như: nonacosanol, hentriacontanol, heptacosanol

1.2.2.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Năm 2008, Lee và cộng sự đã phân lập năm hợp chất thuộc nhóm saponin là Echinocystic acid, Eclalbasaponin II, Eclalbasaponin V, Eclalbasaponin I và Eclalbasaponin III và thử nghiệm hoạt tính chống sự tăng sinh của tế bào hình sao trong bệnh xơ gan Kết quả cho thấy, chỉ có Echinocystic acid và Eclalbasaponin II

có hoạt tính đáng kể đối với thử nghiệm này [57]

Hildebert Wagner và cộng sự đã khảo sát hoạt tính bảo vệ gan trên mô hình gây độc bởi CCl4 của Wedelolactone và Demethylwedelolactone cho thấy cả hai chất đều có hoạt tính tốt IC50 của Wedelolactone là 2.5 μM Ngoài ra, các chất trên còn có tác dụng kích thích tái sinh tế bào gan [54]

Echinocystic acid và Eclalbasaponin II ngăn chặn sự sinh trưởng của các tế bào hình sao của bệnh xơ gan

[57]

Các dẫn xuất tự nhiên và tổng hợp của Wedelolactone có khả năng chống lại

độc tố từ nọc rắn lục Nghiên cứu in vivo mới đây của Paulo A Melo và cộng sự

cho thấy, hiệu quả kháng độc tố và chống phù của 8-metoxy-coumestrol rất cao với

ID50 lần lượt là 0.17 mg/kg và 0.14 mg/kg Tác dụng của Wedelolactone cũng tương đương với hợp chất này [71]

Dae-Ik Kim, Sung-Hyen Lee, Jin-Ho Choi, Hyun Soon Lillehoj, Mi-Hee Yu,

Gun-Soon Lee đã khảo sát các phân đoạn buthanol của Eclipta prostrata (L.) có

hiệu quả làm giảm nồng độ lipid trong huyết thanh và cải thiện các hoạt động chống oxy hóa ở chuột CD [25]; làm tăng sự hình thành của acetylcholine lên não, giảm stress [26]

Năm 2008, Mi Kyeong Lee và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng sinh của triterpenoids từ Eclipta prostrata trên các tế bào gan hình sao [44]

Năm 2009, G Arunachalam và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng

viêm của methanol từ Eclipta prostrata (L.) [28] Kakali Datta và các cộng sự đã

khảo sát dịch chiết Eclipta alba có tiềm năng cho sự thúc đẩy mọc tóc [36]

S Dalal

và các cộng sự đã nghiên cứu Wedelolactone nhƣ là một chất kháng khuẩn chiết xuất từ Eclipta alba [60]

Vanessa A Lenza và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính

kháng khuẩn của dịch chiết Ethanol từ Eclipta alba (L.) [77]

Năm 2010, V K Lal và các cộng sự đã nghiên cứu lá và rễ của Eclipta alba

(L.) trong bảo vệ gan [75]

1.2.2.3 Các hợp chất tiêu biểu đã được cô lập từ Cỏ mực

Bảng 1.2 Các hợp chất tiêu biểu đã được cô lập từ Cỏ mực

 Mp = 327-330C

OH

OH

OHO

 Tinh thể màu vàng nhạt (MeOH)

 Tìm thấy trong

lá Cỏ mực

3 Kaempferol [ 55] C15H10O6,

M = 286 đvC

O

OHO

 Tinh thể hình kim màu vàng (MeOH)

 Mp = 328-330C

 Tìm thấy trong

lá Cỏ mực

OH OH O

OH OH HO

O HO

 Tìm thấy trong

 Tìm thấy trong

 Dạng tinh thể không màu, mp = 279-281C, []28D + 20,4 (c = 1,20;

EtOH)

- Tìm thấy trong toàn cây Cỏ

mực

OH OH

O

- Tìm thấy trong toàn cây Cỏ

mực

15 Eclalbasaponin I

[47], [64], [70]

(3--O-D-glucopyranosyl-

O HO

OH

OH OH

O HO

OH

OH OH

O

O

O

 Dạng tinh thể không màu, mp = 252-254C, []28D + 1

(c = 1,27; MeOH)

 Tìm thấy trong toàn cây

OH

OH OH

 Dạng chất bột, màu trắng,

mp =

237-238C, []28D + 6,8 (c = 1,07;

MeOH)

- Tìm thấy trong toàn cây Cỏ

mực

OH OH O HO

OH

OH OH

O HO

OH

OH OH

O O

 Dạng chất bột vô định hình, []29D

3,1 (c = 1,33; MeOH)

- Tìm thấy trong toàn cây Cỏ

O

OH OH

O HO

OH

OH OH

 Dạng chất bột vô định hình, []29D + 6,3 (c = 1,45; MeOH)

- Tìm thấy trong toàn cây Cỏ

HO

OSO 3 H

OH OH

 Dạng chất bột vô định hình, []22D

9,3 (c = 1,70; MeOH)

 Tìm thấy trong toàn cây

OH OH

O HO

OH

OH OH

O O

 Dạng chất bột vô định hình, []22D + 0,5 (c = 1,43; Pyridine)

- Tìm thấy trong toàn cây Cỏ

OH

OH OH

OH OH

 Dạng chất bột vô định hình, []26D +

15 (c = 0,31; MeOH)

- Tìm thấy trong toàn cây Cỏ

mực

OH OH

OH

OH

 Dạng chất bột vô định hình, []26D

18 (c = 0,33; MeOH) Tìm thấy trong toàn cây Cỏ

đvC

O O HO

OSO3H

OH OH

OH

OH

 Dạng chất bột vô định hình, []25D

12 (c = 0,46; MeOH)

- Tìm thấy trong toàn cây Cỏ

OSO3H

OH OH

OH

OH

 Dạng chất bột vô định hình, []25D 5

(c = 0,29; MeOH)

- Tìm thấy

trong toàn cây Cỏ

OH

OH OH

O

O O

OH

HO OH

 Mp = 256-257C, []20D + 1,5 (c = 1,02;

MeOH)

- Tìm thấy trong toàn cây Cỏ

O

 Dạng chất dầu màu vàng

- Tìm thấy trong rễ Cỏ mực

 Dạng chất dầu màu vàng

 Tìm thấy trong

 Tìm thấy trong

S S S OHC

 Tinh thể màu vàng (CH2Cl2/hexane hoặc

Et2O)

 Mp = 135-136C

 Tìm thấy trong

HO

 Mp = 130-145C

 Tìm thấy trong toàn cây

Cỏ mực

 Mp = 160-164C

 Tìm thấy trong toàn cây

Cỏ mực

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

- Máy đo điểm chảy (melting point) Buchi B450

- Các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY được ghi trên máy

đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR SPECTROMETER) Model DRX500 (tần số

 Cột sắc ký phân tích Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm, hãng Dionex

 Cột sắc ký điều chế pha thuận Inox 25 x 300 mm, cột sắc ký điều chế pha thuận thủy tinh 15 x 450 mm Hạt nhồi pha thuận silicagel cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm Merck

 Bơm sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC10A, Japan, tốc độ dòng max 10 ml/phút

 Sắc ký bản mỏng (TLC): Silicagel GF 60F254 Merck

 Đèn soi bản mỏng bước sóng 254 nm và 365 nm

 Bể lắc siêu âm Elmasonic S 100 H

 Tủ sấy Binder khoảng nhiệt độ 30-280o

C, lò nung Nabertherm Model b150 khoảng nhiệt độ nung 30-1100o

C

 Các loại dung môi Ether dầu hỏa, Ethylacetat, Dichloromethan, Methanol, Acetonitrin, nước cất …

2.2 NGUYÊN LIỆU

2.2.1 Thu hái nguyên liệu

Cây Cỏ mực được thu hái tại xã Hòa phong, huyện Hòa vang, thành phố Đà nẵng Cây Cỏ mực được khoảng ba tháng tuổi

2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu

Cây Cỏ mực được sử dụng toàn bộ phần trên mặt đất, bao gồm thân, lá, hoa

và quả Mẫu nguyên liệu được xử lý loại cỏ dại và rửa sạch phơi khô Xay nghiền nhỏ

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xác định độ ẩm

Mất khối lượng do làm khô là sự giảm khối lượng của mẫu thử biểu thị bằng phần trăm (kl/kl) khi được làm khô trong điều kiện xác định ở mỗi chuyên luận Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng nước, một phần hoặc toàn bộ khối lượng nước kết tinh và lượng chất dễ bay hơi khác trong mẫu thử Việc xác định mất khối lượng do làm khô không được làm thay đổi tính chất lý hóa cơ bản của mẫu thử

Cách tiến hành

Dùng dụng cụ sấy thủy tinh rộng miệng đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử, làm khô bì trong thời gian 30 phút theo phương pháp và điều kiện qui định trong chuyên luận rồi cân để xác định khối lượng bì Cân ngay vào bì này một khối lượng chính xác mẫu thử bằng khối lượng qui định trong chuyên luận với sai số ± 10% Nếu không có chỉ dẫn gì đặc biệt thì lượng mẫu thử được được dàn mỏng thành lớp độ dày không quá 5 mm Nếu mẫu thử có kích thước lớn thì phải nghiền nhanh tới kích thước dưới 2mm trước khi cân Tiến hành làm khô trong điều kiện qui định của chuyên luận Nếu dùng phương pháp sấy thì nhiệt độ chỉ được phép chênh lệch ± 2oC so với nhiệt độ qui định Sau khi sấy phải làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay Nếu chuyên luận không qui định thời gian làm khô có nghĩa là phải làm khô đến khối lượng không đổi, tức là sự chênh lệch của khối lượng sau khi sấy thêm 1 giờ trong tủ sấy hoặc 06 giờ trong bình hút ẩm so với lần sấy trước không quá 0,5 mg

Nếu mẫu thử bị chảy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ qui định thì trước khi đưa lên nhiệt độ đó cần duy trì từ 1 đến 2 giờ ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mẫu thử từ 5oC đến 10o

C

Nếu mẫu thử là dược liệu, khi chuyên luận riêng không có chỉ dẫn gì đặc biệt thì tiến hành sấy trong tủ sấy ở áp suất thường Dược liệu phải được làm thành mảnh nhỏ đường kính không quá 3mm, lượng đem thử từ 2g đến 5g, chiều dày mẫu thử đem sấy là 5mm và không quá 10mm đối với dược liệu có cấu tạo xốp Nhiệt

độ và thời gian sấy theo yêu cầu của chuyên luận riêng

Tính toán hàm lượng ẩm

1 x100

m

m m o

o 



Trong đó : mo : khối lượng cân ban đầu

m1 : khối lượng sau khi sấy

 : độ ẩm tương đối của mẫu tính theo phần trăm

Phương pháp này sử dụng để xác định độ ẩm mẫu cây cỏ mực

2.3.2 Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu

- Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc tro hoá hoàn toàn mẫu bằng cách nung mẫu trong lò nung ở nhiệt độ 800oC khoảng 6 giờ

Phương pháp này sử dụng để xác định hàm lượng tro mẫu cây cỏ mực

2.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC )

Sắc ký là phương pháp tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa 2 pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính hấp thụ, tính tan, )

Trong hệ thống sắc ký, pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký kết hợp pha tĩnh này đến pha tĩnh khác, sẽ lặp

đi lặp lại quá trình hấp thụ, phản hấp thụ Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu