Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phần của phổ cao tần. Tƣơng tác với hạt nhân đƣợc tạo ra với sóng radio( 108
-106Hz).
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân nghiên cứu những bƣớc chuyển của các mức năng lƣợng của hạt nhân thuận từ( hạt nhân có từ tính). Các mức năng lƣợng này là bằng nhau bởi vậy cần một sự tƣơng tác giữa hạt nhân với một từ trƣờng.
Hạt nhân có momen từ (magnetic moment) có thể có những trạng thái năng lƣợng khác nhau khi ở trong một từ trƣờng.
Spin và momen từ của hạt nhân
Thành phần của hạt nhân gồm proton và neutron đều có xung quay riêng( rotation impuls) của chính mình,ký hiệu là Pk
, còn gọi là spin. Ngƣợc với xung quay kinh điển (rotation impuls), spin có những giá trị ngắt quãng. Spin của hạt nhân đƣợc tạo thành về phƣơng diện vectơ là số cộng của thành phần hạt nhân( proton và neutron) theo công thức :
Pk I(I 1) (1) 2 h h : hằng số Planck I : số lƣợng tử spin hạt nhân
Đối với các đồng vị khác nhau I có thể bằng 0,1/2,1,3/2...7.
Khi số thứ tự (số proton) và khối lƣợng (proton + neutron) của một hạt nhân đều là số chẵn thì I=0 hạt nhân không có spin. Đối với những hạt nhân có cả 2 số
là số lẻ hoặc khối lƣợng là số lẻ thì I có thể là 1/2,3/2,5/2,... Trƣờng hợp số thứ tự lẻ, khối lƣợng chẵn thì I=1,2,3... Spin hạt nhân gắn với một momen từ k
k= Pk
.
(2)
: tỷ lệ hồi chuyển của một hạt nhân
Hiện tƣợng tách trạng thái năng lƣợng : Khi không ở trong một từ trƣờng thì các trạng thái năng lƣợng của một dipol hạt nhân bằng nhau. Chúng cùng ở một mức năng lƣợng, năng lƣợng Eo . Trong một từ trƣờng đồng nhất, không đổi, momen hạt nhân tƣơng tác với từ trƣờng. Nếu ta cho trục z trùng hƣớng với đƣờng sức từ trƣờng Hx = Hy= 0
Mỗi hạt nhân sẽ có (2I+1) vị trí momen từ trong từ trƣờng Hz, các trạng thái khác nhau trong từ trƣờng Hz sẽ có mức năng lƣợng khác nhau.
Năng lƣợng tƣơng tác E giữa k và Hz là EmIHz (3)
trạng thái mI= -1/2 có năng lƣợng cao ơn trạng thái mI= +1/2 Khoảng cách giữa hai trạng thái năng lƣợng liền nhau là
E mIHz (4)
Bƣớc nhảy giữa hai mức năng lƣợng liền kề sẽ xảy ra khi hạt nhân đƣợc một điện từ trƣờng cao tần xoay chiều có tần số ν cung cấp năng lƣợng phù hợp với phƣơng trình (4). Trƣờng hợp này sẽ xuất hiện sự cộng hƣởng giữa từ trƣờng xoay chiều và hạt nhân.
Trong quá trình cộng hƣởng, các bƣớc chuyển hóa giữa 2 mức năng lƣợng liền kề, từ mức thấp lên mức cao( hấp thụ) và từ mức cao xuống thấp( phát xạ) có cùng xác xuất. Nhờ có sự khác nhau nhỏ về sự chiếm chỗ trong mức năng lƣợng thấp hơn mà ta quan sát đƣợc sự hấp thụ trong thí nghiệm cộng hƣởng.
Trong quá trình cộng hƣởng, hạt nhân thu năng lƣợng (hấp thụ) từ trƣờng xoay chiều mà ta chiếu vào. Do sự chênh lệch về số chiểm chỗ giữa hai mức năng lƣợng là quá nhỏ nên nhanh chóng bị cân bằng và tín hiệu hấp thụ sẽ biến mất( bão hòa). Mặt khác, hạt nhân cũng cho mất năng lƣợng trong khi cộng hƣởng thông qua trao đổi năng lƣợng với môi trƣờng xung quanh hoặc giữa các hạt nhân với nhau
một cách không phát xạ. Quá trình này gọi là quá trình hồi phục. Quá trình hồi phục có tác dụng chống lại sự " bão hòa" trong khi cộng hƣởng.
Có hai khả năng để xác định sự hấp thụ cộng hƣởng: Hoặc giữa từ trƣờng Ho
cố định và thay đổi tần số của từ trƣờng xoay chiều cao tần hoặc giữa tần số từ trƣờng xoay chiều cố định và thay đổi Ho cho đến khi có cộng hƣởng.
Mẫu nằm giữa hai đầu của một nam châm điện. Từ trƣờng đƣợc tạo thành bởi dòng điện một chiều ổn định.
Từ trƣờng xoay chiều cao tần đƣợc tạo thành bởi một máy phát cao tần và tác động vào mẫu thông qua một cuộn dây.
Để ghi đƣợc phổ Ho thì phải thay đổi(sweep). Việc này do máy sweep thực hiện(sweep gerenator). Năng lƣợng do mẫu giải phòng trở lại đƣợc đƣa đến bộ thu, đƣợc khuyếch đại và đƣa vào máy ghi. Ngƣời ta ghi cƣờng độ tín hiệu theo sự thay đổi cƣờng độ từ trƣờng Ho.
Độ dịch chuyển hóa học δ là đại lƣợng đặc trƣng cho những hạt nhân bị che chắn tƣơng đƣơng của một hợp chất. Nó đƣợc tính bằng ppm và không phụ thuộc vào từ trƣờng của thiết bị Ho.
Thông thƣờng ngƣời ta ghi phổ 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
H NMR và 13C NMR , phổ Cosy, DEP, HMBC, HMQC để xác định công thức cấu tạo của các chất.
2.3.6. Khảo sát thành phần các chất chiết đƣợc trong một số loại dung môi, điều chế cao thô và phân lập, tinh chế các chất từ cao thô, xác định thành phần và cấu tạo chất tinh chế.
2.3.6. Khảo sát sơ bộ thành phần các chất chiết được trong các loại dung môi
Khảo sát sơ bộ thành phần các chất chiết đƣợc trong các loại dung môi Ether dầu hỏa (nhiệt độ sôi 60-90o
C), n hexan, chlorofooc, ethyl acetat, ethanol, methanol và nƣớc cất.
2.3.6.2. Điều chế cao thô
Mẫu Cỏ mực khô đƣợc nạp vào bình tam giác thể tích 1000 ml, đặt mẫu vào bể siêu âm Elmasonic S100H tần số 35KHz, chiết với dung môi ether dầu hỏa (nhiệt độ sôi 6090oC), chiết liên tục trong thời gian 6 giờ. Cô dịch chiết phân
đoạn ether dầu hỏa thu hồi dung môi trên máy cất cô quay áp suất giảm, thu đƣợc cao Ether dầu hỏa ( EPD).
Cắn sau khi chiết ether dầu hỏa bay hơi hết dung môi ether dầu hỏa, chiết tiếp với ethyl acetat, thời gian chiết liên tục 6 giờ. Cô dịch chiết phân đoạn Ethyl acetat thu hồi dung môi trên máy cất cô quay áp suất giảm, thu đƣợc cao Ethyl acetat (EPE).
Cắn sau khi chiết ethyl acetat bay hơi hết dung môi ethyl acetat, chiết tiếp với Methanol, thời gian chiết liên tục 6 giờ. Cất dịch chiết phân đoạn Methanol thu hồi dung môi trên máy cất cô quay áp suất giảm, thu đƣợc cao phân đoạn Methanol (EPM).
2.3.6.3. Phân lập và tinh chế các chất từ cao EPE
Trƣớc khi chạy sắc ký cột cũng nhƣ trong suốt quá trình chạy sắc ký cột chúng tôi sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký bản mỏng(TLC) để kiểm tra, thăm dò các chất có trong cao thô và các phân đoạn, gom các phân đoạn có các vết giống nhau và kiểm tra sơ bộ độ sạch của các chất trong quá trình tinh chế. Sau khi tinh chế dùng HPLC, TLC để kiểm tra độ sạch của chất tinh chế đƣợc.
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đƣợc dùng là hệ thống RSLC Ultimax 3000 hãng Dionex.
Bản mỏng đƣợc dùng là bản nhôm silica gel MERCK-GF 60F254tráng sẵn, kích thƣớc 20 x 20 cm, độ dày lớp hấp phụ 0,22 mm của hãng Merck, Germany. Đèn soi sắc kí đƣợc sử dụng ở bƣớc sóng 254 nm và 365 nm.
2.3.6.4. Xác định thành phần và cấu tạo chất tinh chế
Đo phổ HPLC, UV-Vis, IR, NMR xác định thành phần và cấu tạo chất tinh chế đƣợc trong dịch chiết phân đoạn ethyl acetat.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
3.1.1. Sơ đồ khảo sát điều kiện chiết xuất
Khảo sát thời gian chiết Ethyl acetat Khảo sát tỷ lệ dung
môi ethyl acetat / nguyên liệu Làm sạch Sấy khô Xay nhỏ Khảo sát thành phần chiết trong các dung môi
Ether dầu hỏa n-hexan Chlorofooc Ethyl acetat Ethanol Methanol Nƣớc cất Mẫu cỏ mực Xử lý nguyên liệu Xác định các chỉ tiêu Kim loại nặng Độ ẩm mẫu Hàm lƣợng tro
3.1.2 Sơ đồ phân lập, tinh chế các chất tinh khiết Tinh chế Wedelolactone (110 mg) CAO EPE (6,720 gam) Sắc ký cột silicagel Phân đoạn 1 (0.110g) Phân đoạn 2 (0.062g) Phân đoạn 3 (0.180g) Phân đoạn 4 (2,860g) Phân đoạn 5 (1,120g) Dịch chiết Ethyl acetat
Mẫu sau khi chiết Ethyl acetat
Thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm
Ethyl acetat
Thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm Dung dịch Ether
Mẫu sau khi chiết ether dầu hỏa
Ether dầu hỏa Mẫu cỏ mực
( 400 gam) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2 . XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU 3.2.1. Thu hái nguyên liệu 3.2.1. Thu hái nguyên liệu
Cây Cỏ mực đƣợc thu hái tại xã Hòa phong, huyện Hòa vang, thành phố Đà nẵng. Cây Cỏ mực đƣợc khoảng ba tháng tuổi, khối lƣợng mẫu 6,5 kg.
3.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu
Cây Cỏ mực đƣợc sử dụng toàn bộ phần trên mặt đất, bao gồm thân, lá, hoa và quả. Mẫu nguyên liệu đƣợc xử lý loại cỏ dại và rửa sạch sấy khô trong tủ sấy nhiệt độ sấy 50o
C. Nguyên liệu sau khi sấy đƣợc bảo quản trong bao nilon có chứa chất hút ẩm silicagel. Nguyên liệu đƣợc nghiền nhỏ trong máy xay đƣợc dùng làm mẫu nghiên cứu (700 gam).
3.3. XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU 3.3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu 3.3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu
Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh để đựng mẫu; Tủ sấy; Bình hút ẩm; Cân phân tích.
Cân khoảng 2 g nguyên liệu cỏ mực đã đƣợc sấy khô ở 50oC cho vào cốc thủy tinh đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác. Cho cốc thuỷ tinh có chứa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 105oC. Sau khi sấy khoảng 3 giờ, ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thuỷ tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 60 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hay có sai số khoảng 0,005g thì dừng quá trình sấy.
Dựa vào các kết quả thu đƣợc, khối lƣợng cỏ mực trƣớc và sau khi sấy. Từ đó, ta tính đƣợc độ ẩm theo công thức sau:
Trong đó: - : độ ẩm (%)
- m0: khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy (g) - m1: khối lƣợng mẫu sau khi sấy (g)
Kết quả độ ẩm của mẫu nguyên cứu đƣợc thể hiện trong bảng 3.1
100 . m m m 0 1 0
Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm trong cỏ mực
STT Khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy (g)
Khối lƣợng mẫu sau khi sấy (g)
Khối lƣợng nƣớc trong mẫu (g) Độ ẩm (%) 1 2,0083 1,9028 0,1055 5,25 2 2,0045 1,9014 0,1031 5,14 3 2,0049 1,9267 0,0801 4,00 4 2,0058 1,9248 0,0810 4,04 5 2,0035 1,9242 0,0793 3,96 Độ ẩm bình quân 4,48 %
Nhận xét: Độ ẩm trong mẫu nguyên liệu cỏ mực đã đƣợc sấy ở 50oC, sau khi sấy 105oC khoảng 4,48 ± 0,77 %, độ ẩm trung bình mẫu là 4,48 %.
3.3.2 Xác định hàm lƣợng tro
Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu; Lò nung; Bình hút ẩm; Cân phân tích.
Cân khoảng 2g mẫu cỏ mực mẫu đã đƣợc sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lƣợng. Đặt cốc sứ có chứa cỏ mực lên trên bếp điện tiến hành tro hóa cỏ mực, tiếp tục cho mẫu vào lò nung và nung ở 600o
C trong vòng 1 giờ, nâng nhiệt lò nung lên 800o
C. Sau thời gian tro hóa khoảng 6 giờ, mẫu cỏ mực đã đƣợc tro hoá hoàn toàn. Lúc này tro có dạng bột mịn, màu trắng. Dùng kẹp dài lấy cốc sứ ra khỏi lò nung và cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lƣợng. Sau 30 phút ta tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hoặc sai số 0,001g thì dừng quá trình tro hoá. Hàm lƣợng tro trong lá khô đƣợc tính theo công thức sau: .100 0 1 m m
H H: hàm lƣợng tro trong lá sấy khô (%)
Trong đó: - m0: khối lƣợng mẫu trƣớc khi tro hoá (g) - m1: khối lƣợng tro (g)
Bảng 3.1. Kết quả xác định tỉ lệ tro trong mẫu cỏ mực
Nhận xét: Hàm lƣợng tro trong mẫu khoảng 12,22 ± 0,08%, Hàm lƣợng tro trong mẫu khá lớn
3.3.3 Xác định hàm lƣợng kim loại nặng
Dùng phƣơng pháp AAS để đo hàm lƣợng kim loại trong mẫu cỏ mực. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả xác định hàm lƣợng kim loại trong mẫu cỏ mực đƣợc thể hiện trong bảng 3.2 .
Bảng 3.2. Kết quả phân tích hàm lượng kim loại nặng và so sánh với qui chuẩn kỹ thuật quốc gia.
Stt Khối lƣợng mẫu (gam) Hàm lƣợng (mg/kg) Ghi chú Cd As Hg Pb 1 0,8916 1,2057 0,0447 0,0252 1,4917 2 0,8430 1,5925 0,0563 0,0326 0,7384 3 0,9899 1,4143 0,0556 0,0354 3,4549 Trung bình 1,4042 0,0532 0,0323 1,8950 Qui chuẩn KT quốc
gia 1,0000 1,0000 0,0500 2,0000 Không đạt Đạt Đạt Đạt ST T Khối lƣợng cốc (g) Khối lƣợng mẫu sấy khô
+ cốc trƣớc khi tro hóa
(g) Khối lƣợng mẫu (g) Khối lƣợng mẫu + cốc sau khi tro
hóa (g) Khối lƣợng tro (g) Tỉ lệ tro (%) 1 36,8732 38,8795 2,0063 37,1199 0,2467 12,30 2 32,3669 34,3700 2,0031 32,6110 0,2441 12,19 3 34,9003 36,9029 2,0026 35,1441 0,2438 12,17
Nhận xét : Căn cứ vào kết quả phân tích hàm lƣợng kim loại nặng bằng
phƣơng pháp hấp thu nguyên tử và so sánh với qui chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩmthì hàm lƣợng các kim loại Asen, Thủy ngân, Chì trong mẫu nguyên cứu đạt tiêu chuẩn. Đối với Cadimi mẫu nguyên cứu có hàm lƣợng vƣợt tiêu chuẩn qui định (1,4042/1,000).
3.4. KHẢO SÁT THÀNH PHẦN CÁC CHẤT CHIẾT ĐƢỢC TRONG CÁC DUNG MÔI.
3.4.1. Mục tiêu
Khảo sát này nhằm tìm đƣợc dung môi chiết xuất mẫu cỏ mực có tính chọn lọc thành phần hoạt chất có hàm lƣợng lớn, khá sạch để có thể lấy phân đoạn chiết xuất này tiếp tục dùng sắc kí cột để phân lập, tinh chế và tiếp tục khảo sát thành phần, cấu trúc hóa học của chất, phân lập, tinh chế đƣợc.
3.4.2. Phƣơng pháp chiết
Dùng các dung môi có độ phân cực khác nhau để chiết mẫu là ether dầu hỏa, n-hexan, chlorofooc, ethyl acetat, Ethanol, Methanol và nƣớc. Chiết mẫu trong bể lắc siêu âm Elmasonic S100H tần số 35 Hz. Bể siêu âm cho phép chiết xuất các chất khá nhanh đồng thời nhiệt độ chiết thấp do đó không sợ sự phân hủy, biến đối thành phần và cấu trúc hóa học của các chất chiết đƣợc.
3.4.3. Tiến hành
Chuẩn bị mẫu: Cân vào 07 bình định mức 50 ml mỗi bình khoảng 1gam mẫu
cỏ mực. Bổ sung 35 ml lần lƣợt các dung môi ether dầu hỏa, n hexan, chlorofooc, ethyl acetat, Ethanol, Methanol và nƣớc vào mỗi bình. Lắc trong bể siêu âm 30 phút, lấy mẫu ra để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung các dung môi tƣơng ứng đầy đến vạch, Lọc dịch chiết qua giấy lọc, lọc qua màng lọc 0,45 μm, thu đƣợc mẫu thử chiết trong các dung môi.
Phân tích các dịch chiết trong các dung môi: Dùng phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao để phân tích các dung dịch chiết đƣợc trong các dung môi, dựa vào các peak ghi đƣợc trên phổ đồ với các thời gian lƣu đƣợc xác định ta có thể đánh giá đƣợc sơ bộ thành phần các chất chiết đƣợc trong các dung môi khác nhau Điều kiện sắc ký
Cột sắc ký : Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm Detector DAD: 351 nm
Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.5 ml/phút
Pha động : Acetonitrin : nƣớc cất Thời gian phân tích : 15 phút
Chƣơng trình dung môi theo thời gian Thời gian (Phút) Tốc độ dòng (ml/phút) Acetonitrin (%) Nƣớc dùng cho HPLC (%) 0.00 1.500 5 95 0.00 1.500 5 95 11.50 1.500 45 55 12.00 1.500 5 95 15.00 1.500 5 95
3.4.4. Kết quả : Kết quả phổ đồ xem phần phụ lục
Nhận xét: Dựa trên màu sắc của mẫu chiết đƣợc và phổ đồ HPLC ghi lại sau quá trình phân tích chúng tôi nhận thấy với các dung môi chiết bằng Ether dầu hỏa, n-hexan, Chlorofooc chủ yếu là các chất màu, hoặc các chất có độ phân cực kém hòa tan trong mẫu, trong khi đó các chất có độ hấp thu trong vùng bƣớc sóng 351nm không thấy xuất hiện, hoặc xuất hiện với nồng độ rất nhỏ. Các mẫu phân tích trong nƣớc thành phần tan chủ yếu và có nồng độ cao là các chất có độ phân cực cao và khá cao, các chất có độ phân cực trung bình và kém, tan ít trong môi