Chuẩn bị mẫu: Cân vào 07 bình định mức 50 ml mỗi bình khoảng 1gam mẫu
cỏ mực. Bổ sung 35 ml lần lƣợt các dung môi ether dầu hỏa, n hexan, chlorofooc, ethyl acetat, Ethanol, Methanol và nƣớc vào mỗi bình. Lắc trong bể siêu âm 30 phút, lấy mẫu ra để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung các dung môi tƣơng ứng đầy đến vạch, Lọc dịch chiết qua giấy lọc, lọc qua màng lọc 0,45 μm, thu đƣợc mẫu thử chiết trong các dung môi.
Phân tích các dịch chiết trong các dung môi: Dùng phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao để phân tích các dung dịch chiết đƣợc trong các dung môi, dựa vào các peak ghi đƣợc trên phổ đồ với các thời gian lƣu đƣợc xác định ta có thể đánh giá đƣợc sơ bộ thành phần các chất chiết đƣợc trong các dung môi khác nhau Điều kiện sắc ký
Cột sắc ký : Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm Detector DAD: 351 nm
Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.5 ml/phút
Pha động : Acetonitrin : nƣớc cất Thời gian phân tích : 15 phút
Chƣơng trình dung môi theo thời gian Thời gian (Phút) Tốc độ dòng (ml/phút) Acetonitrin (%) Nƣớc dùng cho HPLC (%) 0.00 1.500 5 95 0.00 1.500 5 95 11.50 1.500 45 55 12.00 1.500 5 95 15.00 1.500 5 95
3.4.4. Kết quả : Kết quả phổ đồ xem phần phụ lục
Nhận xét: Dựa trên màu sắc của mẫu chiết đƣợc và phổ đồ HPLC ghi lại sau quá trình phân tích chúng tôi nhận thấy với các dung môi chiết bằng Ether dầu hỏa, n-hexan, Chlorofooc chủ yếu là các chất màu, hoặc các chất có độ phân cực kém hòa tan trong mẫu, trong khi đó các chất có độ hấp thu trong vùng bƣớc sóng 351nm không thấy xuất hiện, hoặc xuất hiện với nồng độ rất nhỏ. Các mẫu phân tích trong nƣớc thành phần tan chủ yếu và có nồng độ cao là các chất có độ phân cực cao và khá cao, các chất có độ phân cực trung bình và kém, tan ít trong môi trƣờng nƣớc có nồng độ khá thấp. Các mẫu đƣợc chiết trong môi trƣờng Methanol và Ethanol có mầu xanh đậm và trong thành phần hòa tan có rất nhiều các chất có độ phân cực mạnh đến trung bình. Nồng độ, thành phần các chất hòa tan có độ hấp thu ở bƣớc sóng 351nm khá lớn khả năng chiết tách qua cột sẽ gặp nhiều khó khăn để chia tách các chất. Phân đoạn chiết Ethyl aceat đƣợc khảo sát có màu xanh, trên sắc ký đồ nhìn thấy có khoảng 04 chất chiết đƣợc dự đoán có độ phân cực trung
bình và có độ hấp thu tại bƣớc sóng 351 khá lớn do đó phân đoạn chiết này có thể cho phép chạy sắc ký cột để phân lập và tinh chế một số chất tinh khiết, xác định thành phần nhóm chức và cấu tạo của các chất.
Sau quá trình khảo sát chiết xuất cỏ mực bằng các dung môi khác nhau trong cùng điều kiện, dựa vào quan sát bằng cảm quan và căn cứ trên sắc ký đồ ghi lại, đồng thời căn cứ trên khả năng cung cấp dung môi, hóa chất trong phòng thí nghiệm hiện có, trong nghiên cứu này chúng tôi đề nghị sử dụng chọn phƣơng pháp chiết xuất bằng bể lắc siêu âm Elmasonic S100H : Chiết các chất béo, chất màu trong ether dầu hỏa (nhiệt độ sôi ether dầu hỏa nằm trong khoảng 60-90o
C), thu hồi dung môi phân đoạn Ether dầu hỏa trong máy cất cô quay, mẫu tiếp tục chiết bằng Ethyl acetat. Gom dung dịch cỏ mực chiết đƣợc trong phân đoạn Ethyl acetat, cất thu hồi dung môi trên máy cất cô quay Buchi ở áp suất 400 mHg, nhiệt độ 65o
C, thu đƣợc cao phân đoạn ethyl acetat. Từ cao phân đoạn này sẽ đƣợc sử dụng để phân lập và tinh chế các chất tinh khiết.
3.5. KHẢO SÁT TỶ LỆ DUNG MÔI VÀ KHỐI LƢỢNG MẪU CHIẾT XUẤT 3.5.1. Mục tiêu 3.5.1. Mục tiêu
Khảo sát tỷ lệ dung môi ethyl acetat và khối lƣợng nguyên liệu mẫu để có thể chiết đƣợc hàm lƣợng tối ƣu các chất có trong mẫu.
3.5.2. Tiến hành
Chuẩn bị mẫu : Cân mẫu có khối lƣợng tăng dần vào bình định mức 50 ml,
bổ sung 35ml Ethyl acetat vào bình, đậy nắp, siêu âm trong bể siêu âm Elmasonic S100H trong thời gian 30 phút, lấy mẫu ra để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung dung môi đầy đến vạch, Lọc dịch chiết qua giấy lọc, lọc qua màng lọc 0,45 μm, hút chính xác 1 ml dịch lọc vào vial, bay hơi hết dung môi. Bổ sung chính xác 1 ml MeOH vào vialhòa tan hoàn toàn mẫu, thu đƣợc các mẫu thử.
Phân tích các dịch chiết trong các tỷ lệ dung môi: phƣơng pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) đƣợc sử dụng để phân tích các dung dịch chiết đƣợc trong các tỷ lệ dung môi, dựa vào diện tích peak ghi đƣợc trên phổ đồ của peak có thời gian lƣu khoảng 4.1 phút để đánh giá sơ bộ hàm lƣợng chất chiết đƣợc trong các tỷ lệ dung môi khác nhau.
Điều kiện sắc ký
Cột sắc ký : Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm Detector DAD: 351 nm
Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : Nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.0 ml/phút
Pha động : Acetonitrin - nƣớc cất (30:70) Thời gian phân tích : 06 phút
3.5.3. Kết quả
Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi và khối lƣợng mẫu chiết đƣợc trình bày trong bảng 3.5.3
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi và khối lượng mẫu
sst Khối lƣợng mẫu (gam)
Diện tích peak chính Ghi chú
1 0,50045 3,2192 2 1,00043 4,7308 3 1,50081 8,6553 4 2,00102 9,3721 5 2,50071 13,0489, 6 3,00024 16,3235 7 5,50104 46,9498 8 10,01400 83,0671 9 14,01640 109,0231 10 15,17420 125,1621 11 17,9231 126,1621
Tỷ lệ rắn lỏng 0 50 100 150 0 5 10 15 20 Khối lượng D iệ n tíc h
Hình 3.1 Đồ thị thể hiên sự phụ của diện tich pic vào tỷ lệ dung môi và khối lượng mẫu.
Hình 3.2. Phổ đồ phân tích tỷ lệ dung môi và khối lượng mẫu
Nhận xét : Với tỷ lệ dung môi càng lớn thì chất chiết đƣợc có hàm lƣợng càng cao . khi tỷ lệ dung môi và mẫu nguyên liệu đạt : 15g/50 ml thì nồng độ tăng lên không đáng kể. Để tiết kiệm dung môi và thời gian chiết ta sẽ chọn tỷ lệ dung môi và nguyên liệu chiết tƣơng ứng Ethyl acetat / mẫu : 3/1.( v/m)
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 -100 200 400 600 900
1 Ty le ran long 7 UV_VIS_1
2 Ty le ran long 8 UV_VIS_1
3 Ty le ran long 9 UV_VIS_1
4 Ty le ran long 10 UV_VIS_1
5 Ty le ran long 11 UV_VIS_1
mAU min 5 4 3 2 1 1 - 0.398 2 - 0.8913 - 0.932 4 - 1.2475 - 1.2896 - 1.3337 - 1.467 8 - 1.535 9 - Peak 1 - 2.045 10 - 3.725 11 - peak 2 - 4.104 WVL:351 nm
3.6. KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT 3.6.1. Mục tiêu 3.6.1. Mục tiêu
Khảo sát khoảng thời gian tối ƣu chiết mẫu đạt hàm lƣợng cao của chất có trong mẫu.
3.6.2. Tiến hành
Chuẩn bị mẫu : Cân khoảng 5,00 gam mẫu cỏ mực vào bình định mức 50 ml,
bổ sung 50ml Ethyl acetat vào bình, đậy nắp, siêu âm trong bể siêu âm Elmasonic S100H trong thời gian 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,110, 120, 150, 180, 210 phút, sau các khoảng thời gian trên lấy 20 μl mẫu vào vial, bay hơi hết dung môi, bổ sung 0,5 ml MeOH vào vial, đƣợc các mẫu thử, phân tích hàm lƣợng chất chính.
Phân tích các dịch chiết theo thời gian: phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao đƣợc sử dụng để phân tích các dung dịch chiết đƣợc theo thời gian, dựa vào diện tích peak ghi đƣợc trên phổ đồ của peak có thời gian lƣu khoảng 4,1 phút để đánh giá sơ bộ hàm lƣợng chất chiết đƣợc theo thời gian.
Điều kiện sắc ký
Cột sắc ký : Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm Detector DAD: 351 nm
Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : Nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.0 ml/phút
Pha động : Acetonitrin - nƣớc cất (30:70) Thời gian phân tích : 06 phút
3.6.3 Kết quả
Kết quả khảo sát chiết mẫu theo thời gian đƣợc trình bày trong hình 3.3, bảng 3.4 và biểu diễn biểu đồ hình 3.4
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 mAU min 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 - 0.419 2 - 0.927 3 - 1.2834 - 1.331 5 - 1.451 6 - 1.523 7 - Peak 1 - 1.9898 - 2.649 9 - peak 2 - 4.037 WVL:351 nm
Hình 3.3. Phổ đồ khảo sát chất chiết được theo thời gian
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết.
Stt Khối lƣợng mẫu (gam) Thời gian (phút) Diện tích peak
1 5,0023 10 1,4999 2 5,0023 20 2,1338 3 5,0023 30 2,1714 4 5,0023 40 2,4578 5 5,0023 50 2,5722 6 5,0023 60 2,6859 7 5,0023 70 2,7773 8 5,0023 80 3,0063 9 5,0023 90 3,5240 10 5,0023 100 4,4229 11 5,0023 110 4,9193 12 5,0023 120 5,8731 13 5,0023 150 6,6677 14 5,0023 180 7,0503 15 5,0023 210 7,7210
Thời gian chiết 0 2 4 6 8 10 0 50 100 150 200 250 thời gian di ện tí ch diện tích
Hình 3.4. Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của diện tích pic vào thời gian chiết
Nhận xét : Kết quả phân tích đƣợc theo diện tích peak chất có thời gian lƣu 4,4 phút tăng dần theo thời gian chiết. Đến khoảng thời gian 150 phút , 180 phút và 210 phút hàm lƣợng chất tăng lên nhƣng không đáng kể. Khoảng thời gian chiết tối ƣu là 150 phút trong bể siêu âm Elmasonic S100H.
Kết quả khảo sát các điều kiện về dung môi chiết, tỷ lệ dung môi và mẫu, thời gian chiết ta tìm đƣợc các thông số tối ƣu hóa quá trình chiết chất có thời gian lƣu 4,04 phút trong mẫu cây cỏ mực trong bể siêu âm Elmasonic S100H tần số 35 KHz
Chiết mẫu trong ether dầu hỏa( khoảng nhiệt độ sôi 60-90oC) để loại các chất béo, chất mầu, tiếp theo dùng dung môi chiết là Ethyl acetat để chiết tiếp mẫu, tỷ lệ dung môi/ mẫu(v/m) : 3/1 thời gian chiết: 150 phút .
3.7. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ CÁC CHẤT TINH KHIẾT 3.7.1. Mục tiêu
Chiết xuất đƣợc các chất có trong phân đoạn dung môi Ethyl acetat, phân lập và tinh chế đƣợc các chất tinh khiết có trong phân đoạn cao ethyl acetat từ đó xác định độ tinh khiết bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng hiệu năng cao, khi độ tinh khiết đạt lớn hơn 95%, mẫu sẽ đƣợc xác định thành phần các nhóm chức và công thức cấu tạo dựa trên phổ hồng ngoại, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân…
Để thực hiện việc chiết xuất phân lập đƣợc các chất tinh khiết trong đề tài sử dụng phƣơng pháp chiết bằng bể siêu âm Elmasonic S100H tần số 35 KHz, sắc kí điều chế cột pha thuận (cột silicagel). Cột pha thuận sử dụng cột sắc ký điều chế pha thuận Inox 25 x 300 mm, cột sắc ký điều chế pha thuận thủy tinh 15 x 450 mm. Hạt nhồi pha thuận silicagel cỡ hạt 0.040 – 0.063 mm Merck. Bơm sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC10A, Japan, tốc độ dòng max 10 ml/phút để bơm các dung môi vào các cột điều chế. Bay hơi dung môi các phân đoạn có thành phần các chất giống nhau đƣợc sử dụng hệ thống cất cô quay áp suất giảm Buchi. Việc dò tìm các phân đoạn trong quá trình điều chế bằng phƣơng pháp HPLC.
3.7.3. Chiết xuất cao phân đoạn Ethyl acetat
Tiến hành : Cân vào 2 bình tam giác 1000 ml có nắp nút mài mỗi bình 200 gam mẫu cỏ mực, bổ sung 500 ml dung môi ether dầu hỏa đậy nắp bình, lắc trong bể siêu âm 30 phút, gạn dịch chiết ether dầu hỏa, tiến hành chiết Ether dầu hỏa 03 lần. Tập trung dịch chiết Ether dầu hỏa, cô thu hồi dung môi, thu đƣợc cao phân đoạn chiết Ether dầu hỏa ( EPE).
Mẫu sau khi chiết Ether dầu hỏa đƣợc tiếp tục bổ sung 600 ml dung môi Ethyl acetat, lắc siêu âm trong 180 phút, gạn dịch chiết ethyl acetat, tiến hành chiết 03 lần với dung môi Ethyl acetat. Tập trung dịch chiết phân đoạn ethyl acetat cô dƣới áp suất giảm thu đƣợc 6,720 gam cao phân đoạn ethyl actat .
Kết quả : Phổ đồ khảo sát các chất chiết đƣợc trong phân đoạn Ethyl acetat
Nhận xét : Trong phổ đồ cao dịch chiết phân đoạn Ethyl acetat ta nhận thấy thành phần tập trung chủ yếu là các chất có độ phân cực trung bình, có độ hấp thu cực đại tại bƣớc sóng 350- 351nm.
3.7.4. Phân lập, tinh chế chất tinh khiết trong phân đoạn cao Ethyl Acetat 3.7.4.1. Phân lập trên cột sắc kí điều chế pha thuận
Điều kiện sắc kí
Cao EPE tiến hành sắc ký cột trên cột sắc ký điều chế pha thuận Inox 25 x 300 mm, cột sắc ký điều chế thủy tinh 15 x 450 mm, silicagel pha thuận cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm.
Khối lƣợng Silicagel : 60g và 36g Khối lƣợng mẫu : 5 gam
Dung môi ổn định cột : Dichloromethan Mỗi phân đoạn : 30 ml
Tiến hành : Nạp silicagel vào các cột, Cột Inox đƣợc nối tiếp với cột thủy tinh, ổn định cột bằng dung môi dichloromethal trong vòng 60 phút với tốc độ dòng bơm 3ml/phút. Nạp 05 gam mẫu vào bộ nạp mẫu, bắt đầu rửa giải bằng hệ pha động dichloromethan sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethan : methanol. Thu hồi dung dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 30 ml (một phân đoạn). Tổng cộng 120 phân đoạn. Kiểm tra các phân đoạn rửa giải bằng quan sát trực tiếp theo màu sắc và HPLC, gom các phân đoạn có các chất có thời gian lƣu giống nhau vào cùng 1 phân đoạn lớn.
Điều kiện sắc ký kiểm tra các phân đoạn chiết.
Cột sắc ký : Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm Detector DAD: 351 nm
Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : Nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.0 ml/phút
Pha động : Acetonitrin - nƣớc cất (30:70) Thời gian phân tích : 06 phút
Bảng 3.5. Kết quả các phân đoạn sau khi gom
Phân đoạn Hệ dung môi Khối lƣợng (gam) Số peak HPLC
1 CH2Cl2 = 100 0,110 1
2 CH2Cl2 = 100 0,062 1
3 CH2Cl2 : MeOH = 98 : 2 0,180 1
4 CH2Cl2 : MeOH = 95 : 5 2,860 3
5 CH2Cl2 : MeOH = 90 : 10 1,120 3
Nhận xét : Với phân đoạn 1 và 2 là các chất có màu xanh đậm và xanh nhạt
đƣợc tách hoàn toàn rõ ràng trên cột đƣợc gom thành các phân đoạn riêng biệt. Gom các phân đoạn có cùng màu sắc vào 1 phân đoạn, cất cô quay thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm, thu đƣợc cao lần lƣợt các phân đoạn 1: 0,110 gam, phân đoạn 2: 0,062 gam. Phân đoạn 3 sau khi kiểm tra chỉ có 01 peak có thời gian lƣu giống nhau đƣợc gom lại 1 phân đoạn, cất cô quay thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao phân đoạn 3: 0,180 gam trên sắc ký đồ nhận thấy chất này khá tinh khiết tuy còn lẫn
Hình 3.7. Bơm sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC10A, Japan.
Hình 3.6. Cột sắc ký phân tích Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm, hãng Dionex.
màu xanh, hòa tan lại mẫu trong 2 ml Dichloromethan, để yên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm đƣợc kết tinh màu trắng ngà, gạn bỏ dung môi có màu, sấy khô cắn thu đƣợc bằng không khí nóng. Kiểm tra lại độ tinh khiết của chất kết tinh ta đƣợc chất EPE 1. Chất EPE1 đƣợc xác định quang phổ hồng ngoại và cộng hƣởng từ hạt nhân MNR để xác định nhóm chức và công thức cấu tạo của chất
3.8. Xác định các đặc trƣng vật lý, định danh cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc. phân lập đƣợc.
3.8.1. Chất EPE1
3.8.1.1. Các đặc tính của EPPE1
- Là chất rắn kết tinh trong MeOH cho dạng bột màu xám trắng, tan trong