3.3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu
Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh để đựng mẫu; Tủ sấy; Bình hút ẩm; Cân phân tích.
Cân khoảng 2 g nguyên liệu cỏ mực đã đƣợc sấy khô ở 50oC cho vào cốc thủy tinh đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác. Cho cốc thuỷ tinh có chứa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 105oC. Sau khi sấy khoảng 3 giờ, ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thuỷ tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 60 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hay có sai số khoảng 0,005g thì dừng quá trình sấy.
Dựa vào các kết quả thu đƣợc, khối lƣợng cỏ mực trƣớc và sau khi sấy. Từ đó, ta tính đƣợc độ ẩm theo công thức sau:
Trong đó: - : độ ẩm (%)
- m0: khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy (g) - m1: khối lƣợng mẫu sau khi sấy (g)
Kết quả độ ẩm của mẫu nguyên cứu đƣợc thể hiện trong bảng 3.1
100 . m m m 0 1 0
Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm trong cỏ mực
STT Khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy (g)
Khối lƣợng mẫu sau khi sấy (g)
Khối lƣợng nƣớc trong mẫu (g) Độ ẩm (%) 1 2,0083 1,9028 0,1055 5,25 2 2,0045 1,9014 0,1031 5,14 3 2,0049 1,9267 0,0801 4,00 4 2,0058 1,9248 0,0810 4,04 5 2,0035 1,9242 0,0793 3,96 Độ ẩm bình quân 4,48 %
Nhận xét: Độ ẩm trong mẫu nguyên liệu cỏ mực đã đƣợc sấy ở 50oC, sau khi sấy 105oC khoảng 4,48 ± 0,77 %, độ ẩm trung bình mẫu là 4,48 %.
3.3.2 Xác định hàm lƣợng tro
Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu; Lò nung; Bình hút ẩm; Cân phân tích.
Cân khoảng 2g mẫu cỏ mực mẫu đã đƣợc sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lƣợng. Đặt cốc sứ có chứa cỏ mực lên trên bếp điện tiến hành tro hóa cỏ mực, tiếp tục cho mẫu vào lò nung và nung ở 600o
C trong vòng 1 giờ, nâng nhiệt lò nung lên 800o
C. Sau thời gian tro hóa khoảng 6 giờ, mẫu cỏ mực đã đƣợc tro hoá hoàn toàn. Lúc này tro có dạng bột mịn, màu trắng. Dùng kẹp dài lấy cốc sứ ra khỏi lò nung và cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lƣợng. Sau 30 phút ta tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hoặc sai số 0,001g thì dừng quá trình tro hoá. Hàm lƣợng tro trong lá khô đƣợc tính theo công thức sau: .100 0 1 m m
H H: hàm lƣợng tro trong lá sấy khô (%)
Trong đó: - m0: khối lƣợng mẫu trƣớc khi tro hoá (g) - m1: khối lƣợng tro (g)
Bảng 3.1. Kết quả xác định tỉ lệ tro trong mẫu cỏ mực
Nhận xét: Hàm lƣợng tro trong mẫu khoảng 12,22 ± 0,08%, Hàm lƣợng tro trong mẫu khá lớn
3.3.3 Xác định hàm lƣợng kim loại nặng
Dùng phƣơng pháp AAS để đo hàm lƣợng kim loại trong mẫu cỏ mực.
Kết quả xác định hàm lƣợng kim loại trong mẫu cỏ mực đƣợc thể hiện trong bảng 3.2 .
Bảng 3.2. Kết quả phân tích hàm lượng kim loại nặng và so sánh với qui chuẩn kỹ thuật quốc gia.
Stt Khối lƣợng mẫu (gam) Hàm lƣợng (mg/kg) Ghi chú Cd As Hg Pb 1 0,8916 1,2057 0,0447 0,0252 1,4917 2 0,8430 1,5925 0,0563 0,0326 0,7384 3 0,9899 1,4143 0,0556 0,0354 3,4549 Trung bình 1,4042 0,0532 0,0323 1,8950 Qui chuẩn KT quốc
gia 1,0000 1,0000 0,0500 2,0000 Không đạt Đạt Đạt Đạt ST T Khối lƣợng cốc (g) Khối lƣợng mẫu sấy khô
+ cốc trƣớc khi tro hóa
(g) Khối lƣợng mẫu (g) Khối lƣợng mẫu + cốc sau khi tro (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hóa (g) Khối lƣợng tro (g) Tỉ lệ tro (%) 1 36,8732 38,8795 2,0063 37,1199 0,2467 12,30 2 32,3669 34,3700 2,0031 32,6110 0,2441 12,19 3 34,9003 36,9029 2,0026 35,1441 0,2438 12,17
Nhận xét : Căn cứ vào kết quả phân tích hàm lƣợng kim loại nặng bằng
phƣơng pháp hấp thu nguyên tử và so sánh với qui chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩmthì hàm lƣợng các kim loại Asen, Thủy ngân, Chì trong mẫu nguyên cứu đạt tiêu chuẩn. Đối với Cadimi mẫu nguyên cứu có hàm lƣợng vƣợt tiêu chuẩn qui định (1,4042/1,000).
3.4. KHẢO SÁT THÀNH PHẦN CÁC CHẤT CHIẾT ĐƢỢC TRONG CÁC DUNG MÔI.
3.4.1. Mục tiêu
Khảo sát này nhằm tìm đƣợc dung môi chiết xuất mẫu cỏ mực có tính chọn lọc thành phần hoạt chất có hàm lƣợng lớn, khá sạch để có thể lấy phân đoạn chiết xuất này tiếp tục dùng sắc kí cột để phân lập, tinh chế và tiếp tục khảo sát thành phần, cấu trúc hóa học của chất, phân lập, tinh chế đƣợc.
3.4.2. Phƣơng pháp chiết
Dùng các dung môi có độ phân cực khác nhau để chiết mẫu là ether dầu hỏa, n-hexan, chlorofooc, ethyl acetat, Ethanol, Methanol và nƣớc. Chiết mẫu trong bể lắc siêu âm Elmasonic S100H tần số 35 Hz. Bể siêu âm cho phép chiết xuất các chất khá nhanh đồng thời nhiệt độ chiết thấp do đó không sợ sự phân hủy, biến đối thành phần và cấu trúc hóa học của các chất chiết đƣợc.
3.4.3. Tiến hành
Chuẩn bị mẫu: Cân vào 07 bình định mức 50 ml mỗi bình khoảng 1gam mẫu
cỏ mực. Bổ sung 35 ml lần lƣợt các dung môi ether dầu hỏa, n hexan, chlorofooc, ethyl acetat, Ethanol, Methanol và nƣớc vào mỗi bình. Lắc trong bể siêu âm 30 phút, lấy mẫu ra để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung các dung môi tƣơng ứng đầy đến vạch, Lọc dịch chiết qua giấy lọc, lọc qua màng lọc 0,45 μm, thu đƣợc mẫu thử chiết trong các dung môi.
Phân tích các dịch chiết trong các dung môi: Dùng phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao để phân tích các dung dịch chiết đƣợc trong các dung môi, dựa vào các peak ghi đƣợc trên phổ đồ với các thời gian lƣu đƣợc xác định ta có thể đánh giá đƣợc sơ bộ thành phần các chất chiết đƣợc trong các dung môi khác nhau Điều kiện sắc ký
Cột sắc ký : Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm Detector DAD: 351 nm
Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.5 ml/phút
Pha động : Acetonitrin : nƣớc cất Thời gian phân tích : 15 phút
Chƣơng trình dung môi theo thời gian Thời gian (Phút) Tốc độ dòng (ml/phút) Acetonitrin (%) Nƣớc dùng cho HPLC (%) 0.00 1.500 5 95 0.00 1.500 5 95 11.50 1.500 45 55 12.00 1.500 5 95 15.00 1.500 5 95
3.4.4. Kết quả : Kết quả phổ đồ xem phần phụ lục
Nhận xét: Dựa trên màu sắc của mẫu chiết đƣợc và phổ đồ HPLC ghi lại sau quá trình phân tích chúng tôi nhận thấy với các dung môi chiết bằng Ether dầu hỏa, n-hexan, Chlorofooc chủ yếu là các chất màu, hoặc các chất có độ phân cực kém hòa tan trong mẫu, trong khi đó các chất có độ hấp thu trong vùng bƣớc sóng 351nm không thấy xuất hiện, hoặc xuất hiện với nồng độ rất nhỏ. Các mẫu phân tích trong nƣớc thành phần tan chủ yếu và có nồng độ cao là các chất có độ phân cực cao và khá cao, các chất có độ phân cực trung bình và kém, tan ít trong môi trƣờng nƣớc có nồng độ khá thấp. Các mẫu đƣợc chiết trong môi trƣờng Methanol và Ethanol có mầu xanh đậm và trong thành phần hòa tan có rất nhiều các chất có độ phân cực mạnh đến trung bình. Nồng độ, thành phần các chất hòa tan có độ hấp thu ở bƣớc sóng 351nm khá lớn khả năng chiết tách qua cột sẽ gặp nhiều khó khăn để chia tách các chất. Phân đoạn chiết Ethyl aceat đƣợc khảo sát có màu xanh, trên sắc ký đồ nhìn thấy có khoảng 04 chất chiết đƣợc dự đoán có độ phân cực trung
bình và có độ hấp thu tại bƣớc sóng 351 khá lớn do đó phân đoạn chiết này có thể cho phép chạy sắc ký cột để phân lập và tinh chế một số chất tinh khiết, xác định thành phần nhóm chức và cấu tạo của các chất.
Sau quá trình khảo sát chiết xuất cỏ mực bằng các dung môi khác nhau trong cùng điều kiện, dựa vào quan sát bằng cảm quan và căn cứ trên sắc ký đồ ghi lại, đồng thời căn cứ trên khả năng cung cấp dung môi, hóa chất trong phòng thí nghiệm hiện có, trong nghiên cứu này chúng tôi đề nghị sử dụng chọn phƣơng pháp chiết xuất bằng bể lắc siêu âm Elmasonic S100H : Chiết các chất béo, chất màu trong ether dầu hỏa (nhiệt độ sôi ether dầu hỏa nằm trong khoảng 60-90o
C), thu hồi dung môi phân đoạn Ether dầu hỏa trong máy cất cô quay, mẫu tiếp tục chiết bằng Ethyl acetat. Gom dung dịch cỏ mực chiết đƣợc trong phân đoạn Ethyl acetat, cất thu hồi dung môi trên máy cất cô quay Buchi ở áp suất 400 mHg, nhiệt độ 65o
C, thu đƣợc cao phân đoạn ethyl acetat. Từ cao phân đoạn này sẽ đƣợc sử dụng để phân lập và tinh chế các chất tinh khiết.
3.5. KHẢO SÁT TỶ LỆ DUNG MÔI VÀ KHỐI LƢỢNG MẪU CHIẾT XUẤT 3.5.1. Mục tiêu 3.5.1. Mục tiêu
Khảo sát tỷ lệ dung môi ethyl acetat và khối lƣợng nguyên liệu mẫu để có thể chiết đƣợc hàm lƣợng tối ƣu các chất có trong mẫu.
3.5.2. Tiến hành
Chuẩn bị mẫu : Cân mẫu có khối lƣợng tăng dần vào bình định mức 50 ml,
bổ sung 35ml Ethyl acetat vào bình, đậy nắp, siêu âm trong bể siêu âm Elmasonic S100H trong thời gian 30 phút, lấy mẫu ra để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung dung môi đầy đến vạch, Lọc dịch chiết qua giấy lọc, lọc qua màng lọc 0,45 μm, hút chính xác 1 ml dịch lọc vào vial, bay hơi hết dung môi. Bổ sung chính xác 1 ml MeOH vào vialhòa tan hoàn toàn mẫu, thu đƣợc các mẫu thử.
Phân tích các dịch chiết trong các tỷ lệ dung môi: phƣơng pháp sắc ký lỏng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hiệu năng cao (HPLC) đƣợc sử dụng để phân tích các dung dịch chiết đƣợc trong các tỷ lệ dung môi, dựa vào diện tích peak ghi đƣợc trên phổ đồ của peak có thời gian lƣu khoảng 4.1 phút để đánh giá sơ bộ hàm lƣợng chất chiết đƣợc trong các tỷ lệ dung môi khác nhau.
Điều kiện sắc ký
Cột sắc ký : Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm Detector DAD: 351 nm
Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : Nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.0 ml/phút
Pha động : Acetonitrin - nƣớc cất (30:70) Thời gian phân tích : 06 phút
3.5.3. Kết quả
Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi và khối lƣợng mẫu chiết đƣợc trình bày trong bảng 3.5.3
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi và khối lượng mẫu
sst Khối lƣợng mẫu (gam)
Diện tích peak chính Ghi chú
1 0,50045 3,2192 2 1,00043 4,7308 3 1,50081 8,6553 4 2,00102 9,3721 5 2,50071 13,0489, 6 3,00024 16,3235 7 5,50104 46,9498 8 10,01400 83,0671 9 14,01640 109,0231 10 15,17420 125,1621 11 17,9231 126,1621
Tỷ lệ rắn lỏng 0 50 100 150 0 5 10 15 20 Khối lượng D iệ n tíc h
Hình 3.1 Đồ thị thể hiên sự phụ của diện tich pic vào tỷ lệ dung môi và khối lượng mẫu.
Hình 3.2. Phổ đồ phân tích tỷ lệ dung môi và khối lượng mẫu
Nhận xét : Với tỷ lệ dung môi càng lớn thì chất chiết đƣợc có hàm lƣợng càng cao . khi tỷ lệ dung môi và mẫu nguyên liệu đạt : 15g/50 ml thì nồng độ tăng lên không đáng kể. Để tiết kiệm dung môi và thời gian chiết ta sẽ chọn tỷ lệ dung môi và nguyên liệu chiết tƣơng ứng Ethyl acetat / mẫu : 3/1.( v/m)
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 -100 200 400 600 900
1 Ty le ran long 7 UV_VIS_1
2 Ty le ran long 8 UV_VIS_1
3 Ty le ran long 9 UV_VIS_1
4 Ty le ran long 10 UV_VIS_1
5 Ty le ran long 11 UV_VIS_1
mAU min 5 4 3 2 1 1 - 0.398 2 - 0.8913 - 0.932 4 - 1.2475 - 1.2896 - 1.3337 - 1.467 8 - 1.535 9 - Peak 1 - 2.045 10 - 3.725 11 - peak 2 - 4.104 WVL:351 nm
3.6. KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT 3.6.1. Mục tiêu 3.6.1. Mục tiêu
Khảo sát khoảng thời gian tối ƣu chiết mẫu đạt hàm lƣợng cao của chất có trong mẫu.
3.6.2. Tiến hành
Chuẩn bị mẫu : Cân khoảng 5,00 gam mẫu cỏ mực vào bình định mức 50 ml,
bổ sung 50ml Ethyl acetat vào bình, đậy nắp, siêu âm trong bể siêu âm Elmasonic S100H trong thời gian 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,110, 120, 150, 180, 210 phút, sau các khoảng thời gian trên lấy 20 μl mẫu vào vial, bay hơi hết dung môi, bổ sung 0,5 ml MeOH vào vial, đƣợc các mẫu thử, phân tích hàm lƣợng chất chính.
Phân tích các dịch chiết theo thời gian: phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cao đƣợc sử dụng để phân tích các dung dịch chiết đƣợc theo thời gian, dựa vào diện tích peak ghi đƣợc trên phổ đồ của peak có thời gian lƣu khoảng 4,1 phút để đánh giá sơ bộ hàm lƣợng chất chiết đƣợc theo thời gian.
Điều kiện sắc ký
Cột sắc ký : Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm Detector DAD: 351 nm
Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : Nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.0 ml/phút
Pha động : Acetonitrin - nƣớc cất (30:70) Thời gian phân tích : 06 phút
3.6.3 Kết quả
Kết quả khảo sát chiết mẫu theo thời gian đƣợc trình bày trong hình 3.3, bảng 3.4 và biểu diễn biểu đồ hình 3.4
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 mAU min 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 - 0.419 2 - 0.927 3 - 1.2834 - 1.331 5 - 1.451 6 - 1.523 7 - Peak 1 - 1.9898 - 2.649 9 - peak 2 - 4.037 WVL:351 nm
Hình 3.3. Phổ đồ khảo sát chất chiết được theo thời gian
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết.
Stt Khối lƣợng mẫu (gam) Thời gian (phút) Diện tích peak
1 5,0023 10 1,4999 2 5,0023 20 2,1338 3 5,0023 30 2,1714 4 5,0023 40 2,4578 5 5,0023 50 2,5722 6 5,0023 60 2,6859 7 5,0023 70 2,7773 8 5,0023 80 3,0063 9 5,0023 90 3,5240 10 5,0023 100 4,4229 11 5,0023 110 4,9193 12 5,0023 120 5,8731 13 5,0023 150 6,6677 14 5,0023 180 7,0503 15 5,0023 210 7,7210
Thời gian chiết 0 2 4 6 8 10 0 50 100 150 200 250 thời gian di ện tí ch diện tích
Hình 3.4. Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của diện tích pic vào thời gian chiết
Nhận xét : Kết quả phân tích đƣợc theo diện tích peak chất có thời gian lƣu 4,4 phút tăng dần theo thời gian chiết. Đến khoảng thời gian 150 phút , 180 phút và 210 phút hàm lƣợng chất tăng lên nhƣng không đáng kể. Khoảng thời gian chiết tối ƣu là 150 phút trong bể siêu âm Elmasonic S100H.
Kết quả khảo sát các điều kiện về dung môi chiết, tỷ lệ dung môi và mẫu, thời gian chiết ta tìm đƣợc các thông số tối ƣu hóa quá trình chiết chất có thời gian lƣu 4,04 phút trong mẫu cây cỏ mực trong bể siêu âm Elmasonic S100H tần số 35 KHz
Chiết mẫu trong ether dầu hỏa( khoảng nhiệt độ sôi 60-90oC) để loại các chất béo, chất mầu, tiếp theo dùng dung môi chiết là Ethyl acetat để chiết tiếp mẫu, tỷ lệ dung môi/ mẫu(v/m) : 3/1 thời gian chiết: 150 phút .
3.7. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ CÁC CHẤT TINH KHIẾT 3.7.1. Mục tiêu
Chiết xuất đƣợc các chất có trong phân đoạn dung môi Ethyl acetat, phân lập và tinh chế đƣợc các chất tinh khiết có trong phân đoạn cao ethyl acetat từ đó xác định độ tinh khiết bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng hiệu năng cao, khi độ tinh khiết đạt lớn hơn 95%, mẫu sẽ đƣợc xác định thành phần các nhóm chức và công thức cấu tạo dựa trên phổ hồng ngoại, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân…
Để thực hiện việc chiết xuất phân lập đƣợc các chất tinh khiết trong đề tài sử