3.6.1. Mục tiêu
Khảo sát khoảng thời gian tối ƣu chiết mẫu đạt hàm lƣợng cao của chất có trong mẫu.
3.6.2. Tiến hành
Chuẩn bị mẫu : Cân khoảng 5,00 gam mẫu cỏ mực vào bình định mức 50 ml,
bổ sung 50ml Ethyl acetat vào bình, đậy nắp, siêu âm trong bể siêu âm Elmasonic S100H trong thời gian 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,110, 120, 150, 180, 210 phút, sau các khoảng thời gian trên lấy 20 μl mẫu vào vial, bay hơi hết dung môi, bổ sung 0,5 ml MeOH vào vial, đƣợc các mẫu thử, phân tích hàm lƣợng chất chính.
Phân tích các dịch chiết theo thời gian: phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao đƣợc sử dụng để phân tích các dung dịch chiết đƣợc theo thời gian, dựa vào diện tích peak ghi đƣợc trên phổ đồ của peak có thời gian lƣu khoảng 4,1 phút để đánh giá sơ bộ hàm lƣợng chất chiết đƣợc theo thời gian.
Điều kiện sắc ký
Cột sắc ký : Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm Detector DAD: 351 nm
Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : Nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.0 ml/phút
Pha động : Acetonitrin - nƣớc cất (30:70) Thời gian phân tích : 06 phút
3.6.3 Kết quả
Kết quả khảo sát chiết mẫu theo thời gian đƣợc trình bày trong hình 3.3, bảng 3.4 và biểu diễn biểu đồ hình 3.4
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 mAU min 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 - 0.419 2 - 0.927 3 - 1.2834 - 1.331 5 - 1.451 6 - 1.523 7 - Peak 1 - 1.9898 - 2.649 9 - peak 2 - 4.037 WVL:351 nm
Hình 3.3. Phổ đồ khảo sát chất chiết được theo thời gian
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết.
Stt Khối lƣợng mẫu (gam) Thời gian (phút) Diện tích peak
1 5,0023 10 1,4999 2 5,0023 20 2,1338 3 5,0023 30 2,1714 4 5,0023 40 2,4578 5 5,0023 50 2,5722 6 5,0023 60 2,6859 7 5,0023 70 2,7773 8 5,0023 80 3,0063 9 5,0023 90 3,5240 10 5,0023 100 4,4229 11 5,0023 110 4,9193 12 5,0023 120 5,8731 13 5,0023 150 6,6677 14 5,0023 180 7,0503 15 5,0023 210 7,7210
Thời gian chiết 0 2 4 6 8 10 0 50 100 150 200 250 thời gian di ện tí ch diện tích
Hình 3.4. Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của diện tích pic vào thời gian chiết
Nhận xét : Kết quả phân tích đƣợc theo diện tích peak chất có thời gian lƣu 4,4 phút tăng dần theo thời gian chiết. Đến khoảng thời gian 150 phút , 180 phút và 210 phút hàm lƣợng chất tăng lên nhƣng không đáng kể. Khoảng thời gian chiết tối ƣu là 150 phút trong bể siêu âm Elmasonic S100H.
Kết quả khảo sát các điều kiện về dung môi chiết, tỷ lệ dung môi và mẫu, thời gian chiết ta tìm đƣợc các thông số tối ƣu hóa quá trình chiết chất có thời gian lƣu 4,04 phút trong mẫu cây cỏ mực trong bể siêu âm Elmasonic S100H tần số 35 KHz
Chiết mẫu trong ether dầu hỏa( khoảng nhiệt độ sôi 60-90oC) để loại các chất béo, chất mầu, tiếp theo dùng dung môi chiết là Ethyl acetat để chiết tiếp mẫu, tỷ lệ dung môi/ mẫu(v/m) : 3/1 thời gian chiết: 150 phút .
3.7. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ CÁC CHẤT TINH KHIẾT 3.7.1. Mục tiêu
Chiết xuất đƣợc các chất có trong phân đoạn dung môi Ethyl acetat, phân lập và tinh chế đƣợc các chất tinh khiết có trong phân đoạn cao ethyl acetat từ đó xác định độ tinh khiết bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng hiệu năng cao, khi độ tinh khiết đạt lớn hơn 95%, mẫu sẽ đƣợc xác định thành phần các nhóm chức và công thức cấu tạo dựa trên phổ hồng ngoại, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân…
Để thực hiện việc chiết xuất phân lập đƣợc các chất tinh khiết trong đề tài sử dụng phƣơng pháp chiết bằng bể siêu âm Elmasonic S100H tần số 35 KHz, sắc kí điều chế cột pha thuận (cột silicagel). Cột pha thuận sử dụng cột sắc ký điều chế pha thuận Inox 25 x 300 mm, cột sắc ký điều chế pha thuận thủy tinh 15 x 450 mm. Hạt nhồi pha thuận silicagel cỡ hạt 0.040 – 0.063 mm Merck. Bơm sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC10A, Japan, tốc độ dòng max 10 ml/phút để bơm các dung môi vào các cột điều chế. Bay hơi dung môi các phân đoạn có thành phần các chất giống nhau đƣợc sử dụng hệ thống cất cô quay áp suất giảm Buchi. Việc dò tìm các phân đoạn trong quá trình điều chế bằng phƣơng pháp HPLC.
3.7.3. Chiết xuất cao phân đoạn Ethyl acetat
Tiến hành : Cân vào 2 bình tam giác 1000 ml có nắp nút mài mỗi bình 200 gam mẫu cỏ mực, bổ sung 500 ml dung môi ether dầu hỏa đậy nắp bình, lắc trong bể siêu âm 30 phút, gạn dịch chiết ether dầu hỏa, tiến hành chiết Ether dầu hỏa 03 lần. Tập trung dịch chiết Ether dầu hỏa, cô thu hồi dung môi, thu đƣợc cao phân đoạn chiết Ether dầu hỏa ( EPE).
Mẫu sau khi chiết Ether dầu hỏa đƣợc tiếp tục bổ sung 600 ml dung môi Ethyl acetat, lắc siêu âm trong 180 phút, gạn dịch chiết ethyl acetat, tiến hành chiết 03 lần với dung môi Ethyl acetat. Tập trung dịch chiết phân đoạn ethyl acetat cô dƣới áp suất giảm thu đƣợc 6,720 gam cao phân đoạn ethyl actat .
Kết quả : Phổ đồ khảo sát các chất chiết đƣợc trong phân đoạn Ethyl acetat (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét : Trong phổ đồ cao dịch chiết phân đoạn Ethyl acetat ta nhận thấy thành phần tập trung chủ yếu là các chất có độ phân cực trung bình, có độ hấp thu cực đại tại bƣớc sóng 350- 351nm.
3.7.4. Phân lập, tinh chế chất tinh khiết trong phân đoạn cao Ethyl Acetat 3.7.4.1. Phân lập trên cột sắc kí điều chế pha thuận
Điều kiện sắc kí
Cao EPE tiến hành sắc ký cột trên cột sắc ký điều chế pha thuận Inox 25 x 300 mm, cột sắc ký điều chế thủy tinh 15 x 450 mm, silicagel pha thuận cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm.
Khối lƣợng Silicagel : 60g và 36g Khối lƣợng mẫu : 5 gam
Dung môi ổn định cột : Dichloromethan Mỗi phân đoạn : 30 ml
Tiến hành : Nạp silicagel vào các cột, Cột Inox đƣợc nối tiếp với cột thủy tinh, ổn định cột bằng dung môi dichloromethal trong vòng 60 phút với tốc độ dòng bơm 3ml/phút. Nạp 05 gam mẫu vào bộ nạp mẫu, bắt đầu rửa giải bằng hệ pha động dichloromethan sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethan : methanol. Thu hồi dung dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 30 ml (một phân đoạn). Tổng cộng 120 phân đoạn. Kiểm tra các phân đoạn rửa giải bằng quan sát trực tiếp theo màu sắc và HPLC, gom các phân đoạn có các chất có thời gian lƣu giống nhau vào cùng 1 phân đoạn lớn.
Điều kiện sắc ký kiểm tra các phân đoạn chiết.
Cột sắc ký : Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm Detector DAD: 351 nm
Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : Nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.0 ml/phút
Pha động : Acetonitrin - nƣớc cất (30:70) Thời gian phân tích : 06 phút
Bảng 3.5. Kết quả các phân đoạn sau khi gom
Phân đoạn Hệ dung môi Khối lƣợng (gam) Số peak HPLC
1 CH2Cl2 = 100 0,110 1
2 CH2Cl2 = 100 0,062 1
3 CH2Cl2 : MeOH = 98 : 2 0,180 1
4 CH2Cl2 : MeOH = 95 : 5 2,860 3
5 CH2Cl2 : MeOH = 90 : 10 1,120 3
Nhận xét : Với phân đoạn 1 và 2 là các chất có màu xanh đậm và xanh nhạt
đƣợc tách hoàn toàn rõ ràng trên cột đƣợc gom thành các phân đoạn riêng biệt. Gom các phân đoạn có cùng màu sắc vào 1 phân đoạn, cất cô quay thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm, thu đƣợc cao lần lƣợt các phân đoạn 1: 0,110 gam, phân đoạn 2: 0,062 gam. Phân đoạn 3 sau khi kiểm tra chỉ có 01 peak có thời gian lƣu giống nhau đƣợc gom lại 1 phân đoạn, cất cô quay thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao phân đoạn 3: 0,180 gam trên sắc ký đồ nhận thấy chất này khá tinh khiết tuy còn lẫn
Hình 3.7. Bơm sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC10A, Japan.
Hình 3.6. Cột sắc ký phân tích Acclaim ®120 C18, 3μ 4,6x100 mm, hãng Dionex.
màu xanh, hòa tan lại mẫu trong 2 ml Dichloromethan, để yên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm đƣợc kết tinh màu trắng ngà, gạn bỏ dung môi có màu, sấy khô cắn thu đƣợc bằng không khí nóng. Kiểm tra lại độ tinh khiết của chất kết tinh ta đƣợc chất EPE 1. Chất EPE1 đƣợc xác định quang phổ hồng ngoại và cộng hƣởng từ hạt nhân MNR để xác định nhóm chức và công thức cấu tạo của chất
3.8. Xác định các đặc trƣng vật lý, định danh cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc. phân lập đƣợc.
3.8.1. Chất EPE1
3.8.1.1. Các đặc tính của EPPE1
- Là chất rắn kết tinh trong MeOH cho dạng bột màu xám trắng, tan trong hỗn hợp EtOAc/MeOH.
- Điểm chảy: mp = 318 – 320°C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3. 8. Chất bột EPE1 Hình 3.9. TLC của EPE1 (CHCl3: MeOH = 8:2)
- Sắc ký bản mỏng (TLC) hiện màu tự nhiên
• Giải ly bằng hệ CHCl3: MeOH: Acid Acetic = 9:1:0.05 cho vết tròn màu xanh nhạt có Rf = 0,6.
- Sắc kí lỏng hiệu năng cao với điều kiện phân tích
Detector DAD: 351 nm Thể tích tiêm : 20 μl
Nhiệt độ : Nhiệt độ phòng thí nghiệm Tốc độ dòng : 1.0 ml/phút
Pha động : Acetonitrin - nƣớc cất (30:70)
Cho peak có thời gian lƣu 4.4 phút . Độ tinh khiết peak theo diện tích đạt 95,4% Sắc kí đồ :
Hình 3.10. Sắc kí đồ của Chất EPE1
3.8.1.2. Nhận danh cấu trúc EPE1
− Phổ MS cho mũi chính m/z [M+H]+
= 315. Suy ra phân tử khối của EPE1 là 314 đvC ứng với công thức phân tử C16H10O7.
− Phổ 13C- NMR (DMSO, ppm) xuất hiện tín hiệu của 16 carbon kết hợp phổ DEPT cho thấy EPE1 có 1 nhóm >C=O; 4 carbon =CH-; 3 carbon >C=; 7 carbon =C-O-; 1 carbon –CH3. (Bảng 3.6)
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ 13
C-NMR và DEPT của EPE1
13C (ppm)
DEPT 90 DEPT 135 Kết luận
55,63 Biến mất Mũi dƣơng –CH3 93,09 Mũi dƣơng Mũi dƣơng =CH- 96,65 Biến mất Biến mất >C= 98,08 Mũi dƣơng Mũi dƣơng =CH- 98,77 Mũi dƣơng Mũi dƣơng =CH- 101,55 Biến mất Biến mất >C= 104,45 Mũi dƣơng Mũi dƣơng =CH- 113,63 Biến mất Biến mất >C= 144,22 Biến mất Biến mất =C-O- 145,31 Biến mất Biến mất =C-O- 148,77 Biến mất Biến mất =C-O- 155,19 Biến mất Biến mất =C-O- 157,65 Biến mất Biến mất =C-O- 158,85 Biến mất Biến mất >C=O 162,16 Biến mất Biến mất =C-O- − Phổ 1H-NMR (DMSO, δ ppm, 500 MHz) cho thấy có: + 1 mũi đơn tại 3,82 là 3 proton của 1 nhóm OCH3.
+ 2 mũi ở 7,16 (s); 7,24 (s) là tín hiệu các proton vòng thơm ở vị trí para.
+ 2 mũi ở 6,45 (d, J = 2,5 Hz) và 6,61 (d, J = 2 Hz) là tín hiệu proton vòng thơm ở vị trí meta.
− Phổ 13
C-NMR (DMSO, ppm) cho thấy chất EPE1 có 16 mũi tín hiệu carbon, trong đó:
+ 1 mũi ở 158,85 là của nhóm δ lacton.
+ 4 mũi ở 98,08; 93,09; 98,77 và 104,45 là tín hiệu của 4 nhóm CH kề nối đôi (CH=).
+ 10 mũi ở 101,55; 157,65; 96,65; 162,16; 148,77; 145,31; 155,19; 144,22 và 113,63 là tín hiệu của 10 carbon tứ cấp kề nối đôi.
+ 1 mũi ở 55,63 là cacbon của nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene. Phổ HMBC cho thấy nhóm OCH3 này tƣơng tác với C7 (δ = 162,16).
− Phổ HMBC (Bảng 3.7) cho thấy sự tƣơng tác giữa H với C tại các vị trí C mà H có thể tƣơng tác: H6→C4a, 7, 8, 8a; H8→C4a, 6, 7, 8a; H10→C9, 11, 12, 14 ; H13→C3, 9, 11, 12; H15→C7.
Tóm lại, dựa vào các kết quả phổ cộng hƣởng từ hạt nhân, các đặc trƣng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố [21, 71] chúng tôi nhận danh chất EPE1 là 5,11,12-Trihydroxy-7-methoxycoumestan (Wedelolactone).
Cấu trúc hóa học của EPE1: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
O O H3CO OH OH OH O 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10 11 12 13 14 15 5, 11, 12-Trihydroxy-7-methoxycoumestan (1, 8, 9-Trihydroxy-3-methoxycoumestan)
Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HMBC của EPE1
Vị trí C/H Nhóm 13C- NMR (ppm) 1 H-NMR ( ppm, J = Hz) HMBC 1 H13 C 2 >C=O 158,85 3 >C= 101,55 4 =C-O- 157,65 4a >C= 96,65
5 =C-O- 157,65 6 =CH- 98,08 6,45 (1H, d, 2,5) H6→C4a, 7, 8, 8a 7 =C-O- 162,16 8 =CH- 93,09 6,61 (1H, d, 2,0) H8→C4a, 6, 7, 8a 8a =C-O- 155,19 9 =C-O- 148,77 10 =CH- 98,77 7,16 (1H, s) H10→C9, 11, 12, 14 11 =C-O- 145,31 12 =C-O- 144,22 13 =CH- 104,45 7,24 (1H, s) H13→C3, 9, 11, 12 14 >C= 113,63 15 –CH3 55,63 3,82 (3H, s) H15→C7
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Sau nhiều tháng nghiên cứu về cây Cỏ mực có nguồn gốc ở Hòa vang Thành phố Đà nẵng, chúng tôi đã đạt đƣợc một số kết quả nhƣ sau:
1- Đã tiến hành thực hiện các mô tả, vi phẫu, soi bột và các phản ứng hóa học định danh đúng cây cỏ mực có tên khoa học: Eclipta prostrata (L.) [Eclipta alba (L) Hassk.],Họ: Cúc (Asteraceae)
2- Đã tiến hành khảo sát chiết xuất cây cỏ mực trong các dung môi Ether dầu hỏa (nhiệt độ sôi 60-90o
C), n-hexan, chlorofooc, Ethyl acetat, ethanol, Methanol, nƣớc. Đã tìm đƣợc phân đoạn chiết Ethyl acetat có nhóm các hoạt chất có hàm lƣợng các chất có độ phân cực trung bình và độ hấp thu cực đại tại bƣớc sóng 351nm.
3- Đã khảo sát đƣợc tỷ lệ dung môi - nguyên liệu và thời gian chiết xuất phù hợp để thực hiện chiết xuất .
4- Từ cao Ethyl acetat đã phân lập và nhận danh đƣợc chất
Tên chất CTPT Cấu trúc Wedolelactone (EPE1) C16H10O7 O O H3CO OH OH OH O 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 9 10 11 12 13 14 15 KIẾN NGHỊ
1- Tiếp tục phân lập, tinh chế các chất có trong cây cỏ mực trong các phân đoạn dung môi chiết Ethanol, Methnol và trong nƣớc .
2-Tiến hành phân lập khối lƣợng lớn hơn các chất wedelolactone và đủ để thử hoạt tính kháng oxy hóa, kháng sinh của wedelolactone. Xác đinh đƣợc hoạt tính sinh học của các chất trên nhằm ứng dụng vào sản xuất thuốc uống dùng cho ngƣời.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
[1] Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, trang 51-52. [2] Chu Phạm Ngọc Sơn (2009), Bài giảng các phương pháp phân tích hiện
đại- Phổ nghiệm chuyên sâu.
[3] Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, cuốn (2), trang 462-467.
[4] Đỗ Quỳnh Nhƣ, Huỳnh Anh Lan, Nguyễn Thị Bay (2007), Hiệu quả giảm đau của cỏ mực và pyralvex trong điều trị apthous niêm mạc miệng, Y Học
TP. Hồ Chí Minh, Tập 11, Phụ bản của Số 2.
[5] Đỗ Tất Lợi (1995), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, trang 367-368.
[6] Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[7] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ,
Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[8] Nguyễn Ngọc Hạnh (2002), Tách chiết và cô lập các hợp chất thiên nhiên, Giáo trình cao học, Viện Công nghệ Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, Thành phố Hồ Chí Minh.
[9] Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Diễm Hồng (2002), Thăm dò tác dụng của cỏ mực trên đường huyết, Tạp chí dƣợc liệu, tập 7, số 3, trang 82-86.
[10] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu cây thuốc, Nhà xuất bản Y học. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[11] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, tập III, Nhà xuất bản trẻ,
trang 272.
[13] Trần Vũ Thiên, Phùng Văn Trung, Nguyễn Ngọc Hạnh (2009), Phân lập Echinocystic acid và Eclalbasaponin II từ cây cỏ mực Eclipta prostrata. Họ cúc (Asteraceae), Tạp chí Khoa học, Trƣờng Đại học Cần Thơ, số 11, 278-283.
[14] Võ Thanh Thúy (2000), Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của cây
Cỏ mực Eclipta Alba Hassk họ Cúc (Compositae), Đại học Khoa học Tự nhiên,
Thành phố Hồ Chí Minh.