Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Xác định độ ẩm

Mất khối lƣợng do làm khô là sự giảm khối lƣợng của mẫu thử biểu thị bằng phần trăm (kl/kl) khi đƣợc làm khô trong điều kiện xác định ở mỗi chuyên luận. Phƣơng pháp này dùng để xác định hàm lƣợng nƣớc, một phần hoặc toàn bộ khối lƣợng nƣớc kết tinh và lƣợng chất dễ bay hơi khác trong mẫu thử. Việc xác định mất khối lƣợng do làm khô không đƣợc làm thay đổi tính chất lý hóa cơ bản của mẫu thử .

Cách tiến hành

Dùng dụng cụ sấy thủy tinh rộng miệng đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử, làm khô bì trong thời gian 30 phút theo phƣơng pháp và điều kiện qui định trong chuyên luận rồi cân để xác định khối lƣợng bì. Cân ngay vào bì này một khối lƣợng chính xác mẫu thử bằng khối lƣợng qui định trong chuyên luận với sai số ± 10%. Nếu không có chỉ dẫn gì đặc biệt thì lƣợng mẫu thử đƣợc đƣợc dàn mỏng thành lớp độ dày không quá 5 mm. Nếu mẫu thử có kích thƣớc lớn thì phải nghiền nhanh tới kích thƣớc dƣới 2mm trƣớc khi cân. Tiến hành làm khô trong điều kiện qui định của chuyên luận. Nếu dùng phƣơng pháp sấy thì nhiệt độ chỉ đƣợc phép chênh lệch ± 2oC so với nhiệt độ qui định. Sau khi sấy phải làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay. Nếu chuyên luận không qui định thời gian làm khô có nghĩa là phải làm khô đến khối lƣợng không đổi, tức là sự chênh lệch của khối lƣợng sau khi sấy thêm 1 giờ trong tủ sấy hoặc 06 giờ trong bình hút ẩm so với lần sấy trƣớc không quá 0,5 mg.

Nếu mẫu thử bị chảy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ qui định thì trƣớc khi đƣa lên nhiệt độ đó cần duy trì từ 1 đến 2 giờ ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mẫu thử từ 5oC đến 10o

C.

Nếu mẫu thử là dƣợc liệu, khi chuyên luận riêng không có chỉ dẫn gì đặc biệt thì tiến hành sấy trong tủ sấy ở áp suất thƣờng. Dƣợc liệu phải đƣợc làm thành mảnh nhỏ đƣờng kính không quá 3mm, lƣợng đem thử từ 2g đến 5g, chiều dày mẫu thử đem sấy là 5mm và không quá 10mm đối với dƣợc liệu có cấu tạo xốp. Nhiệt độ và thời gian sấy theo yêu cầu của chuyên luận riêng.

Tính toán hàm lƣợng ẩm 1 x100 m m m o o   

Trong đó : mo : khối lƣợng cân ban đầu m1 : khối lƣợng sau khi sấy

 : độ ẩm tƣơng đối của mẫu tính theo phần trăm

Phƣơng pháp này sử dụng để xác định độ ẩm mẫu cây cỏ mực.

2.3.2 Xác định hàm lƣợng tro của nguyên liệu

- Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc tro hoá hoàn toàn mẫu bằng cách nung mẫu trong lò nung ở nhiệt độ 800oC khoảng 6 giờ.

Phƣơng pháp này sử dụng để xác định hàm lƣợng tro mẫu cây cỏ mực.

2.3.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC )

Sắc ký là phƣơng pháp tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa 2 pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tƣơng ứng với tính chất của chúng (tính hấp thụ, tính tan, ...)

Trong hệ thống sắc ký, pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký kết hợp pha tĩnh này đến pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp thụ, phản hấp thụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu

hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.

Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để định tính, định lƣợng, kiểm tra thành phần các chất có mặt trong các phân đoạn chiết trong dung môi khác nhau và các phân đoạn điều chế sắc ký cột mẫu cỏ mực.

2.3.4. Phƣơng pháp phổ hấp thu nguyên tử (AAS)

Phƣơng pháp phân tích phổ hấp thu nguyên tử dùng để phân tích lƣợng nhỏ (lƣợng vết) các kim loại trong các loại mẫu khác nhau của các chất vô cơ và hữu cơ. Phƣơng pháp này cho phép định lƣợng đƣợc hầu hết các kim lọai (khoảng 65 nguyên tố) và một số á kim ở giới hạn nồng độ cỡ ppm (microgam) đến nồng độ ppb (nanogam).

Nguyên tắc: Trong điều kiện bình thƣờng nguyên tử không thu và cũng không phát ra năng lƣợng dƣới dạng các bức xạ. Nhƣng khi nguyên tử ở trạng thái hơi tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bƣớc sóng (tần số) xác định vào đám hơi nguyên tử đó, thì các nguyên tử đó sẽ hấp thu các bức xạ có bƣớc sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thể phát ra đƣợc trong quá trình phát xạ của nó. Lúc này nguyên tử chuyển lên trạng thái kích thích có năng lƣợng cao hơn trạng thái cơ bản. Quá trình đó đƣợc gọi là quá trình hấp thu năng lƣợng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ nguyên tử cuả nguyên tố đó. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thu nguyên tử.

Muốn có phổ hấp thu nguyên tử trƣớc hết phải tạo ra đƣợc đám hơi nguyên tử tự do, và sau đó chiếu vào nó một chùm tia sáng có những bƣớc sóng nhất định ứng đúng với các tia phát xạ nhạy của nguyên tố cần nguyên cứu. Dựa vào mối quan hệ giữa cƣờng độ của vạch phổ hấp thu và nồng độ của nguyên tố đó trong đám hơi ta có thể xác định đƣợc nồng độ của nguyên tố cần phân tích.

Dựa vào phƣơng trình cơ sở của phép đo định lƣợng các nguyên tố theo phổ hấp thu nguyên tử, để xác định nồng độ chất cần phân tích.

D = a.C.b

b : Hằng số bản chất, phụ thuộc vào từng vạch phổ của từng nguyên tố, 0<b<=1.

a : = K.Ka: Hằng số thực nghiệm, phụ thuộc vào tất cả các điều kiện thực nghiệm để hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu.

D: Cƣờng độ vạch phổ hấp thu nguyên tử.

Dùng phƣơng pháp phổ hấp thu nguyên tử để xác định hàm lƣợng các kim loại Pb, Zn, Cd, As, Hg trong mẫu cỏ mực.

2.3.5. Phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phần của phổ cao tần. Tƣơng tác với hạt nhân đƣợc tạo ra với sóng radio( 108 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

-106Hz).

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân nghiên cứu những bƣớc chuyển của các mức năng lƣợng của hạt nhân thuận từ( hạt nhân có từ tính). Các mức năng lƣợng này là bằng nhau bởi vậy cần một sự tƣơng tác giữa hạt nhân với một từ trƣờng.

Hạt nhân có momen từ (magnetic moment) có thể có những trạng thái năng lƣợng khác nhau khi ở trong một từ trƣờng.

Spin và momen từ của hạt nhân

Thành phần của hạt nhân gồm proton và neutron đều có xung quay riêng( rotation impuls) của chính mình,ký hiệu là Pk

, còn gọi là spin. Ngƣợc với xung quay kinh điển (rotation impuls), spin có những giá trị ngắt quãng. Spin của hạt nhân đƣợc tạo thành về phƣơng diện vectơ là số cộng của thành phần hạt nhân( proton và neutron) theo công thức :

Pk  I(I 1) (1)   2 h  h : hằng số Planck I : số lƣợng tử spin hạt nhân

Đối với các đồng vị khác nhau I có thể bằng 0,1/2,1,3/2...7.

Khi số thứ tự (số proton) và khối lƣợng (proton + neutron) của một hạt nhân đều là số chẵn thì I=0  hạt nhân không có spin. Đối với những hạt nhân có cả 2 số

là số lẻ hoặc khối lƣợng là số lẻ thì I có thể là 1/2,3/2,5/2,... Trƣờng hợp số thứ tự lẻ, khối lƣợng chẵn thì I=1,2,3... Spin hạt nhân gắn với một momen từ k

k= Pk

.

 (2)

 : tỷ lệ hồi chuyển của một hạt nhân

Hiện tƣợng tách trạng thái năng lƣợng : Khi không ở trong một từ trƣờng thì các trạng thái năng lƣợng của một dipol hạt nhân bằng nhau. Chúng cùng ở một mức năng lƣợng, năng lƣợng Eo . Trong một từ trƣờng đồng nhất, không đổi, momen hạt nhân tƣơng tác với từ trƣờng. Nếu ta cho trục z trùng hƣớng với đƣờng sức từ trƣờng  Hx = Hy= 0

Mỗi hạt nhân sẽ có (2I+1) vị trí momen từ trong từ trƣờng Hz, các trạng thái khác nhau trong từ trƣờng Hz sẽ có mức năng lƣợng khác nhau.

Năng lƣợng tƣơng tác E giữa k và Hz là EmIHz (3)

 trạng thái mI= -1/2 có năng lƣợng cao ơn trạng thái mI= +1/2 Khoảng cách giữa hai trạng thái năng lƣợng liền nhau là

E  mIHz (4)

Bƣớc nhảy giữa hai mức năng lƣợng liền kề sẽ xảy ra khi hạt nhân đƣợc một điện từ trƣờng cao tần xoay chiều có tần số ν cung cấp năng lƣợng phù hợp với phƣơng trình (4). Trƣờng hợp này sẽ xuất hiện sự cộng hƣởng giữa từ trƣờng xoay chiều và hạt nhân.

Trong quá trình cộng hƣởng, các bƣớc chuyển hóa giữa 2 mức năng lƣợng liền kề, từ mức thấp lên mức cao( hấp thụ) và từ mức cao xuống thấp( phát xạ) có cùng xác xuất. Nhờ có sự khác nhau nhỏ về sự chiếm chỗ trong mức năng lƣợng thấp hơn mà ta quan sát đƣợc sự hấp thụ trong thí nghiệm cộng hƣởng.

Trong quá trình cộng hƣởng, hạt nhân thu năng lƣợng (hấp thụ) từ trƣờng xoay chiều mà ta chiếu vào. Do sự chênh lệch về số chiểm chỗ giữa hai mức năng lƣợng là quá nhỏ nên nhanh chóng bị cân bằng và tín hiệu hấp thụ sẽ biến mất( bão hòa). Mặt khác, hạt nhân cũng cho mất năng lƣợng trong khi cộng hƣởng thông qua trao đổi năng lƣợng với môi trƣờng xung quanh hoặc giữa các hạt nhân với nhau

một cách không phát xạ. Quá trình này gọi là quá trình hồi phục. Quá trình hồi phục có tác dụng chống lại sự " bão hòa" trong khi cộng hƣởng.

Có hai khả năng để xác định sự hấp thụ cộng hƣởng: Hoặc giữa từ trƣờng Ho

cố định và thay đổi tần số của từ trƣờng xoay chiều cao tần hoặc giữa tần số từ trƣờng xoay chiều cố định và thay đổi Ho cho đến khi có cộng hƣởng.

Mẫu nằm giữa hai đầu của một nam châm điện. Từ trƣờng đƣợc tạo thành bởi dòng điện một chiều ổn định.

Từ trƣờng xoay chiều cao tần đƣợc tạo thành bởi một máy phát cao tần và tác động vào mẫu thông qua một cuộn dây.

Để ghi đƣợc phổ Ho thì phải thay đổi(sweep). Việc này do máy sweep thực hiện(sweep gerenator). Năng lƣợng do mẫu giải phòng trở lại đƣợc đƣa đến bộ thu, đƣợc khuyếch đại và đƣa vào máy ghi. Ngƣời ta ghi cƣờng độ tín hiệu theo sự thay đổi cƣờng độ từ trƣờng Ho.

Độ dịch chuyển hóa học δ là đại lƣợng đặc trƣng cho những hạt nhân bị che chắn tƣơng đƣơng của một hợp chất. Nó đƣợc tính bằng ppm và không phụ thuộc vào từ trƣờng của thiết bị Ho.

Thông thƣờng ngƣời ta ghi phổ 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

H NMR và 13C NMR , phổ Cosy, DEP, HMBC, HMQC để xác định công thức cấu tạo của các chất.

2.3.6. Khảo sát thành phần các chất chiết đƣợc trong một số loại dung môi, điều chế cao thô và phân lập, tinh chế các chất từ cao thô, xác định thành phần và cấu tạo chất tinh chế.

2.3.6. Khảo sát sơ bộ thành phần các chất chiết được trong các loại dung môi

Khảo sát sơ bộ thành phần các chất chiết đƣợc trong các loại dung môi Ether dầu hỏa (nhiệt độ sôi 60-90o

C), n hexan, chlorofooc, ethyl acetat, ethanol, methanol và nƣớc cất.

2.3.6.2. Điều chế cao thô

Mẫu Cỏ mực khô đƣợc nạp vào bình tam giác thể tích 1000 ml, đặt mẫu vào bể siêu âm Elmasonic S100H tần số 35KHz, chiết với dung môi ether dầu hỏa (nhiệt độ sôi 6090oC), chiết liên tục trong thời gian 6 giờ. Cô dịch chiết phân

đoạn ether dầu hỏa thu hồi dung môi trên máy cất cô quay áp suất giảm, thu đƣợc cao Ether dầu hỏa ( EPD).

Cắn sau khi chiết ether dầu hỏa bay hơi hết dung môi ether dầu hỏa, chiết tiếp với ethyl acetat, thời gian chiết liên tục 6 giờ. Cô dịch chiết phân đoạn Ethyl acetat thu hồi dung môi trên máy cất cô quay áp suất giảm, thu đƣợc cao Ethyl acetat (EPE).

Cắn sau khi chiết ethyl acetat bay hơi hết dung môi ethyl acetat, chiết tiếp với Methanol, thời gian chiết liên tục 6 giờ. Cất dịch chiết phân đoạn Methanol thu hồi dung môi trên máy cất cô quay áp suất giảm, thu đƣợc cao phân đoạn Methanol (EPM).

2.3.6.3. Phân lập và tinh chế các chất từ cao EPE

Trƣớc khi chạy sắc ký cột cũng nhƣ trong suốt quá trình chạy sắc ký cột chúng tôi sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký bản mỏng(TLC) để kiểm tra, thăm dò các chất có trong cao thô và các phân đoạn, gom các phân đoạn có các vết giống nhau và kiểm tra sơ bộ độ sạch của các chất trong quá trình tinh chế. Sau khi tinh chế dùng HPLC, TLC để kiểm tra độ sạch của chất tinh chế đƣợc.

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đƣợc dùng là hệ thống RSLC Ultimax 3000 hãng Dionex.

Bản mỏng đƣợc dùng là bản nhôm silica gel MERCK-GF 60F254tráng sẵn, kích thƣớc 20 x 20 cm, độ dày lớp hấp phụ 0,22 mm của hãng Merck, Germany. Đèn soi sắc kí đƣợc sử dụng ở bƣớc sóng 254 nm và 365 nm.

2.3.6.4. Xác định thành phần và cấu tạo chất tinh chế

Đo phổ HPLC, UV-Vis, IR, NMR xác định thành phần và cấu tạo chất tinh chế đƣợc trong dịch chiết phân đoạn ethyl acetat.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

3.1.1. Sơ đồ khảo sát điều kiện chiết xuất

Khảo sát thời gian chiết Ethyl acetat Khảo sát tỷ lệ dung

môi ethyl acetat / nguyên liệu Làm sạch Sấy khô Xay nhỏ Khảo sát thành phần chiết trong các dung môi

Ether dầu hỏa n-hexan Chlorofooc Ethyl acetat Ethanol Methanol Nƣớc cất Mẫu cỏ mực Xử lý nguyên liệu Xác định các chỉ tiêu Kim loại nặng Độ ẩm mẫu Hàm lƣợng tro

3.1.2 Sơ đồ phân lập, tinh chế các chất tinh khiết Tinh chế Wedelolactone (110 mg) CAO EPE (6,720 gam) Sắc ký cột silicagel Phân đoạn 1 (0.110g) Phân đoạn 2 (0.062g) Phân đoạn 3 (0.180g) Phân đoạn 4 (2,860g) Phân đoạn 5 (1,120g) Dịch chiết Ethyl acetat

Mẫu sau khi chiết Ethyl acetat

Thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm

 Ethyl acetat

Thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm Dung dịch Ether

Mẫu sau khi chiết ether dầu hỏa

 Ether dầu hỏa Mẫu cỏ mực

( 400 gam) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

3.2 . XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU 3.2.1. Thu hái nguyên liệu 3.2.1. Thu hái nguyên liệu

Cây Cỏ mực đƣợc thu hái tại xã Hòa phong, huyện Hòa vang, thành phố Đà nẵng. Cây Cỏ mực đƣợc khoảng ba tháng tuổi, khối lƣợng mẫu 6,5 kg.

3.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu

Cây Cỏ mực đƣợc sử dụng toàn bộ phần trên mặt đất, bao gồm thân, lá, hoa và quả. Mẫu nguyên liệu đƣợc xử lý loại cỏ dại và rửa sạch sấy khô trong tủ sấy nhiệt độ sấy 50o

C. Nguyên liệu sau khi sấy đƣợc bảo quản trong bao nilon có chứa chất hút ẩm silicagel. Nguyên liệu đƣợc nghiền nhỏ trong máy xay đƣợc dùng làm mẫu nghiên cứu (700 gam).

3.3. XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU 3.3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu 3.3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu

Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh để đựng mẫu; Tủ sấy; Bình hút ẩm; Cân phân tích.

Cân khoảng 2 g nguyên liệu cỏ mực đã đƣợc sấy khô ở 50oC cho vào cốc thủy tinh đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác. Cho cốc thuỷ tinh có chứa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 105oC. Sau khi sấy khoảng 3 giờ, ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thuỷ tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 60 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hay có sai số khoảng 0,005g thì dừng quá trình sấy.

Dựa vào các kết quả thu đƣợc, khối lƣợng cỏ mực trƣớc và sau khi sấy. Từ