IV. ENZYM TRONG TRAO ðỔ IL ƯU HUỲNH
2. Oxy và sự sinh trưởng của vi sinh vật
Sự có mặt hay vắng mặt phân tử oxy (O2) có thể là vô cùng quan trọng ñối với sự sinh trưởng của VSV. Một số VSV gọi là VSV hảo khí ñòi hỏi có oxy, trong khi các VSV khác gọi là VSV yếm khí lại không sử dụng oxy. Một lý do khiến VSV yếm khí bắt buộc không thể chịu ñược sự có mặt của oxy là chúng thiếu catalaza và kết quả là sự tích luỹ hydro peroxyt gây chết tế bào. Các loài hảo khí chịu khí có thể không sử dụng oxy nhưng chịu ñược nó kha tốt, mặc dù sự sinh trưởng của chúng có thể ñược tăng cường trong ñiều kiện vi hảo khí hầu
Một số loại vi khuẩn chịu khi một phần sinh trưởng tốt nhất trong khí quyển có nồng ñộ CO2 tăng (7-10%) và nồng ñộ O2 thấp hơn. Chúng sẽ sinh trưởng trong môi trường ñặc ở ñộ sâu mà một lượng nhỏ oxy có thể tản mạn vào. ðể nuôi cấy các VSV chịu khí một phần trên ñĩa petri và môi trường không nghèo ñi, một bình cây nến ñược sử dụng. Các ñĩa và ống nghiệm xử lý ñược ñặt trong bình lớn với một cây nến sáng. Sau khi ñậy nút, tắt nến ñi khi nồng ñộ oxy giảm. Các VSV có khả năng sống trong ñiều kiện có hoặc không có oxy gọi là VSV yêm khí không bắt buộc.
4 giống vi khuẩn thiếu catalaza là Streptococcus, Leucconostoc,
Lactobacillus và Clostridium. Trong ñó Clostridium là yếm khí bắt buộc, còn 3 giống kia yếm khí chịu khí. 3 loài này không có hệ thống xytocrom ñể sản sinh ra hydro peroxyt, do ñó không cần catalaza. Việc xác ñịnh sự có hay không có mặt catalaza là rất hữu ích trong ñịnh loại vi khuẩn. Khi một vài giọt hydro peroxyt 3% ñược cho vào khuẩn lạc và catalaza hiện diện, phân tử oxy ñược giải phóng ra dưới dạng bọt khí.
Trong phòng thí nghiệm, chúng ta có thể nuôi cấy vi khuẩn yếm khí bắt buộc hoặc không bắt buộc bằng cách loại trừ oxy tự do từ môi trường hoặc sử dụng môi trường biến ñổi. Nhiều phương pháp nuôi cấy VSV yếm khí giải quyết ñược cả 2 quá trình này. Tất cả các phương pháp nuôi cấy VSV yếm khí chỉ hiệu quả nếu như mẫu hay các VSV nuôi cấy ñược thu thập và chuyển ñi theo cách làm giảm thiểu sự biểu lộ của oxy.
2.1. Vật liệu
ðĩa petri chứa môi trường dinh dưỡng
ống nghiệm chứa môi trường Thioglycolat có chỉ thị Bình ủ yếm khí Hydro peroxyt 3% 2.2. Dịch nuôi cấy Alcaligenes Clostridium Enterococus Escherichia coli 2.3. Thủ tục tiến hành - Không lắc ống Thioglycolat.
- Dán nhãn 4 ống canh thang và nhiễm mỗi ống một vòng que cấy một loại vi khuẩn trong ñiều kiện vô trùng.
- Nuôi ở 35oC
- Ghi lại sự xuất hiện sinh trưởng ở mỗi ống.
- Dùng bút ñánh dấu dưới ñáy chia mỗi ñĩa thạch thành 4 phần. Dán nhãn 1 ñĩa hào khí và 1 ñĩa yếm khí.
- Ria cấy 1 ñường ñơn các vi khuẩn trên mỗi phần ñĩa.
- ðặt ngược ñĩa hảo khí nuôi ở 35oC. ðĩa yếm khí ñược ñặt ngược trong bình ủ.
- Người hướng dẫn sẽ chứng minh làm thế nào ñể bình trở thành yếm khí. 10 ml nước ñược thêm vào túi ñiều chỉnh khí Gas-Pak (xúc tác hydro kết hợp oxy tạo thành nước, phản ứng sẽ dừng lại khi thêm nước vào) ñặt trong bình với chỉ thị xanh methylen. Khi có mặt của oxy chỉ thị có màu xanh, chuyển thành trắng khi oxy giảm ñi.
- Nuôi bình ở 35oC
- Sau khi nuôi cấy, ghi lại sự sinh trưởng của vi khuẩn trên mỗi ñĩa.
- Thực hiện kiểm tra thử catalaza bằng cách cho thêm vài giọt H2O2 3% vào các khuẩn lạc khác nhau trên ñĩa thạch. Test catalaza dương tính sẽ sinh ra bọt bong bóng trắng. Có thể dùng kính hiển vi ñể xác ñịnh rõ hơn các bọt bóng. Test thử catalaza cũng có thể ñược thực hiện trên lam kính. Vi khuẩn sinh trưởng trên môi trường thạch máu có thể sử dụng phương pháp này.