Protein là thành phần quan trọng của cả hạt và rễ cây trồng. Chúng là thành phần chức năng và cấu trúc cơ bản của thành tế bào cây và chiếm 1/3 nitơ tổng số trong ñất. Protein cung cấp cho ñất lấy từ tất cả xác các sinh vật, ñộng thực vật. Protein trong ñất ñược phân huỷ nhanh chóng nhờ nhiều loại vi khuẩn và nấm. Trong quá trình phân giải, proteaza ngoại bào thực hiện việc cắt ñứt các liên kết peptit ñể tạo ra các polypeptit và oligopeptit, kết quả là sau ñó giải phóng ra các hợp chất có phân tử lượng thấp và ñược tích luỹ bởi VSV. Nhờ vào proteaza ñược giải phóng từ các tế bào VSV, các enzym trong ñất này ñược hấp thụ vào các keo ñất hoặc gắn hoá trị vào vật chất hữu cơ ñất. Các enzym cố ñịnh này chỉ rõ khả năng ñề kháng cao ñối với sự phân giải protein. Ngược lại, proteaza bị ức chế bởi sự làm khô.
Nhiều phương pháp ñã ñược sử dụng ñể phân tích hoạt ñộng của proteaza, ureaza, amidaza,… ở trong ñất. Mặc dù nhiều loại enzym tham gia vào trao ñổi nitơ ñã ñược xác ñịnh, vẫn có ít thông tin về nitrat reductaza. Trong ñiều kiện yếm khí, nitrat ñược biến ñổi thành NO2-, N2O, N2. Trong quá trình phản nitrat hoá, men dị hoá nitrat reductaza xúc tác giai ñoạn ñầu tiên biến ñổi NO3- thành NO2- trong ñiều kiện yếm khí. Nghiên cứu của Cooper và Smith (1963) ñã chỉ rõ rằng tỉ lệ giới hạn quá trình phản nitrat hoá trong ñất axit là sự biến ñổi NO3-, trong ñất kiềm là sự biến ñôỉ NO2-. Trong bài tập này, một phương pháp chính xác, ñơn giản và nhạy ñược sử dụng ñể xác ñịnh nitrat reductaza trong ñất (theo Abdelmagid và Tabatabai).
Dùng KNO3 là chất nền, mẫu ñất ñược nuôi ở 25oC trong 24h dưới ñiều kiện ẩm trong ống nghiệm. Nitrit reductaza bị ức chế do thêm vào 2,4 dinitrophenol. Sau khi nuôi cấy, nitrit giải phóng ra ñược chiết xuất bằng dung dịch KCl và xác ñịnh bằng máy so màu ở bước sóng 520 nm.
- 2,4 dinitrophenol 0,9 mM (166,6 mg/l) - Dung dịch chất nền: KNO3 25mM (2,53g/l) - KCl 4M (298,24g/l)
- ðệm NH4Cl 0,19M, pH=8,5 (10g/900ml, ñiều chỉnh pH bằng KOH 8,5%, lên thể tích ñến 1000ml)
- Thuốc thử màu: Hoà 2g sunphanil amin và 0,1 g N-(1-naphthyl)- etylendiamin hydroclorit trong 150 ml nước cất, thêm 20 ml H3PO4 ñặc, làm nguội ở nhiệt ñộ phòng và pha loãng ñến 200 ml nước cất trong bình ñịnh mức. Dung dịch không màu và chỉ dùng trong ngày.
- Dung dịch tiêu chuẩn mẹ: NO2- 1000àg/ml (4,9257g NaNO2/l), giữ ở 4oC
- Dung dịch ño chuẩn (NO2- 10àg/ml) : pha loãng dung dịch mẹ (5ml/500ml)
- Dãy hiệu giá chuẩn: 0; 0,2; 0,4; 0,8; 1 àg NO2-/ml . Pha cho mỗi lần ño.
2. Thủ tục tiến hành
- Cân 5g ñất ẩm vào 5 ống nghiệm. Dùng pipet thêm 4ml dung dịch 2-4 DNP, 1ml dịch nền, trộn nhanh rồi ñậy nắp lại.
- Ủ 2 ống ở 25oC/24h và 1 ống ở -20oC/24h (ống ñối chứng), sau khi ủ làm tan ở nhiệt ñộ phòng.
- Thêm 10ml KCl vào cả 2 mẫu và ñối chứng, lắc nhẹ rồi lọc ngay.
- ðể so màu cho 5ml dịch lọc, 3ml ñệm NH4Cl và 2ml thuốc thử màu vào ống nghiệm, trộn ñều và ñể ñứng 15 phút ở nhiệt ñộ phòng.
- ðo mẫu và ñối chứng ở 520nm dựa vào phản ứng ñối chứng trắng. So sánh với ñường cong hiệu chỉnh chuẩn (xử lý 5ml dãy hiệu chỉnh chuẩn giống như dịch lọc).
3. Tính kết quả
Tính lượng àg N của dung dịch thử từ ñường cong chuẩn (S-C).20.100 = µg N.g-1 dm.2h-1 5.5. % dm Trong ñó: S: Giá trị mẫu (µg N) C: ðối chứng (µg N)
20: Lượng chiết xuất (ml)
5: ước số dịch lọc (ml)
5: Lượng mẫu ẩm ban ñầu (g)