Trong tự nhiên, hầu hết VSV sinh trưởng trong môi trường có chứa nhiều loại VSV khác nhau. Việc nuôi cấy hỗn hợp ít ñược sử dụng trong nghiên cứu VSV bởi vì khó khăn trong việc xác ñịnh riêng rẽ từng loại vì khi ñó chúng cùng các vi sinh vật khác cùng biểu lộ các hoạt tính. Nuôi cấy thuần khiết, chỉ chứa một loại VSV ñơn là yêu cầu trong các khái niệm nghiên cứu như ñặc tính, bệnh phát sinh, trao ñổi chất và khả năng kháng kháng sinh…
Trong những năm 1970, Joseph Lister ñã ñặt vấn ñề nuôi cấy thuần khiết bằng cách tiến hành dãy pha loãng tới khi mỗi một ô về mặt lý thuyết chỉ chứa một vi khuẩn. Tuy nhiên, sự thành công là rất giới hạn và sự tạp nhiễm (có mặt các VSV không mong muốn) rất phổ biến. Năm 1980, Robert Koch ñặt nền móng cho môi trường ñặc, nhờ ñó các nhà VSV học có thể tách rời VSV bằng pha loãng và thu nhận chúng trên môi trường ñặc. Một vi khuẩn ñược phát hiện dựa trên sự hình thành khuẩn lạc có thể nhìn thấy ñược chỉ chứa một loại VSV.
Hiện nay có 3 phương pháp nuôi cấy thường ñược sử dụng ñể phân lập VSV: ria ñĩa, gạt ñĩa và ñổ ñĩa. Trong kỹ thuật ria ñĩa, một que cấy tròn ñược sử dụng ñể tạo vệt mẫu trộn nhiều lần trên bề mặt của môi trường nuôi cấy rắn trong ñĩa Petri. Về mặt lý thuyết, dùng que cấy tròn tạo vệt nhắc lại cho bề mặt thạch, VSV lần lượt rơi khỏi que cấy ñược phân bố ñồng ñều trên mặt thạch, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc. Cấy ria ñĩa là một kĩ thuật phân lập ñang ñược sử dụng ngày nay.
Cấy gạt và ñổ ñĩa là kỹ thuật ñịnh lượng cho phép xác ñịnh số lượng VSV trong một mẫu cơ chất. Trong kỹ thuật gạt ñĩa, một số lượng nhỏ mẫu pha loãng xác ñịnh ñược gạt trên ñĩa môi trường ñặc bằng cách sử dụng một que uốn cong (hình dạng giống như một chiếc gậy hockey). Trong kỹ thuật ñổ ñĩa, một lượng nhỏ mẫu pha loãng ñược trộn với thạch nóng chảy và ñổ trực tiếp vào ñĩa Petri vô trùng còn rỗng. Sau khi nuôi, VSV sinh trưởng có thể nhìn thấy là các khuẩn
lạc trên hoặc trong ñĩa thạch ñã ñổ. ðể xác ñịnh số lượng VSV trong một mẫu ban ñầu, các ñĩa với số khuẩn lạc từ 25-250 ñược lựa chọn. ít hơn 25 khuẩn lạc là không ñúng bởi vì một sự tạp nhiễm ñơn gây ra ít nhất 4% sai số. Một ñĩa có lớn hơn 250 khuẩn lạc thì khó ñếm. Số lượng VSV trong mẫu ban ñầu ñược tính theo phương trình sau:
Số lượng khuẩn lạc VSV/ml =
ñộ pha loãng
1. Vật liệu
ðĩa Petri chứa môi trường thạch Ống nghiệm chứa thạch nóng chảy ðĩa Petri vô trùng, bình nón 250 ml Pipet 1 ml vô trùng, pipet bóp bóng Môi trường thạch nghiêng
Dịch nuôi cấy: 2 loại vi khuẩn
2. Thủ tục tiến hành
a. Dán nhãn vào ñáy của 2 ñĩa môi trường tương ứng với 2 loại dịch nuôi cấy. b. Khử trùng que cấy: hơ nóng ñỏ ñầu que cấy, làm nguội rồi lấy vô trùng một vòng que cấy dịch VSV
c. Thao tác tạo vết cấy có thể thực hiện với các ñĩa Petri ñặt trên bàn hoặc trên tay.
- Nhấc một mép của ñĩa petri lên và cấy ở phần ñầu tiên bằng cách tạo các ñường không chồng nhau (ñường rích rắc). Không ñược làm xước mặt thạch trong khi cấy.
- Khử trùng que cấy, quay ñĩa tiếp và ria qua một khu vực của phần thứ hai sang phần thứ ba hoặc ria trên phần còn lại của bề mặt thạch, cần cẩn thận tránh tạo các ñường chạm vào các phần cấy trước ñó.
- Khử trùng que cấy trước khi cắm lại vào giá ñựng.
d. Có thể ria cấy trên nhiều ñĩa với một vài loại dịch VSV. Sau ñó dán nhãn, ghi tên người thực hiện, ngày và nguồn dịch nuôi cấy.
e. Nuôi các ñĩa vừa cấy ở 30- 35oC trong tủ ñịnh ôn cho tới khi phát hiện các khuẩn lạc riêng rẽ phát triển (thường từ 24-48 h). Chú ý khi ñặt các ñĩa Petri trong tủ phải ñể ngược lại cho phần nắp ñĩa xuống phía dưới.
g. Sau khi nuôi cấy, ghi lại kết quả
h. Tiếp tục cấy chuyền từ một khuẩn lạc ñơn dòng sang ñĩa môi trường mới nhiều lần cho ñến khi thu ñược giống thuần khiết. Sau ñó cấy từ một khuẩn lạc trên ñĩa ñã thuần vào ống môi trường thạch nghiêng ñể giữ giống.