III. MÔI TRƯỜNG CHUYÊN TÍNH
1. Cácb ước phân tích
1.1 Dụng cụ phân tích:
- Bình tam giác, bình cầu, ống nghiệm (dung tích: 10ml, 100ml, 250 ml), Pipét chia ñộ 0,1 - 1,0 ml, 2ml, 5 ml, 10 ml), hộp nhôm, que cấy, que gạt, bi thủy tinh, giấy quỳ, khay men, cuốc, khoan ….Tất cả các dụng cụ ñều phải tiệt trùng.
+ Môi trường nuôi cấy VSV ñã khử trùng (Bài 3)
1.2 Chuẩn bị bình nước vô trùng làm dãy pha loãng:
Chuẩn bị 10 bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 100ml hoặc 250 ml. Cho vào mỗi bình 90 ml nước máy (thường cho 92 ml, vì khi khử trùng bốc hơi khoảng 2 ml). ðem bình các bình ñã có nước tiệt trùng hơi ở 1 atm (1210C) qua 30 phút. Lấy ra ñể nguôi sẽ ñược dãy pha loãng, ñánh số thứ tự từ 1 ñến 10.
1.3 Xác ñịnh ñộ ẩm mẫu cần phân tích:
Cân 10 gam mẫu cơ chất tươi cho vào hộp nhôm, có thể cân cả trong lượng họpp nhôm khi chưa có mẫu phân tích, sau ñó ñem sấy ở tủ sấy nhiệt ñộ 105 0C qua 4 giờ, ñem hộp nhôm ñã sấy ra cho vào bình hút ẩm cho ñến khi nguội. ðem cân trọng lượng, sau ñó sấy nhiều lần như vậy ñến khi trọng lượng không thay ñổi, thì tính ñộ ẩm của mẫu phân tích theo công thức sau:
A - B
ðộ ẩm X% = --- x 100 B - C
X: ðộ ẩm %
A: Khối lượng hộp + cơ chất còn ướt. B: Khối lượng hộp + cơ chất ñã sấy khô.
Tính hệ số khô kiệt k:
1 k = ---
1 - x
1.4. Chuẩn bị dãy pha loãng
Muốn ñếm ñược số lượng vi sinh vật dễ dàng, khi phân tích cần pha loãng cơ chất ñến một ñộ nhất ñịnh. Cần lưu ý rằng làm dãn mật ñộ VSV phải pha loãng tỷ lệ luôn luôn = 1/10
- Cân 10g cơ chất cho vào bình thứ nhất ñã có 90 ml nước vô trùng, lắc 15 - 20 phút, trên máy lắc 150 lần/ phút. Như vậy chúng ta ñã có dung dịch pha loãng 10-1, nghĩa là tỷ lệ 1:10.
- Dùng pipet 10ml hút 10 ml dung dịch ở nồng ñộ 10-1 cho vào 90 ml nước ở ống bình thứ 2, lắc ñều, chúng ta có nồng ñộ pha loãng 10-2 , tỷ lệ 1:100.
- Tiếp tục làm như vậy ñối với các bình thứ 3, 4…ñến khi chúng ta có ñược dãy pha loãng cần thiết, tỷ lệ 10-3 , 10-4 ,10 …
Chú ý: các pipet ñều phải khử trùng, mối một nồng ñộ pha loãng phải dùng 1 pipet riêng.
Có thể chuẩn bị dãy pha loãng bằng ống nghiệm có chứa 9 ml nước, hoặc bình tam giác có chứa 45 ml nước vô trùng …. rồi ñem khử trùng như làm với bình tam giác. Nếu làm bằng ống nghiệm, thì chỉ cân 1 gam cơ chất khô, hoặc 5 gam cơ chất khô. Nghĩa là ta vẫn tạo ñược dãy pha loãng tỷ lệ 1:10. ðể phân tán ñều dịch cơ chất trong ống nghiệm dùng pipet hút dịch ñưa lên ñưa xuống nhiều lần nhưng không thổi khí.
2. Nuôi cấy
Khi ñã có dung dịch pha loãng rồi, dùng pipét 0,1 ml lấy từ bình pha loãng nào ñó trong dãy pha loang cấy vào trong môi trường ñã chuẩn bị sẵn cho từng nhóm hoặc từng giống VSV ñịnh phân tích. Mỗi nồng ñộ ít nhất phải cấy 3 - 5 lần nhắc lại (số lần nhắc lại càng nhiều, thì kết quả có ñộ tin cậy càng cao). Cần cấy ít nhất ở 3 nồng ñộ pha loãng liên tiếp. Cấy xong dung que gạt thủy tinh vô trùng dàn ñều dịch cấy trên mặt môi trường (nếu môi trường rắn hoặc bán rắn trên ñĩa môi trường thạch). Còn cấy vào trong môi trường dung dịch trong các ống nghiệm hoặc bình dung dịch dinh dưỡng chỉ cân lắc nhẹ là xong.
Chú ý tất cả các hộp lồng hoặc các bình môi trường thí nghiệm ñều phải ñánh số thứ tự theo nguyên tắc sau: số mẫu nghiên cứu nồng ñộ pha loãng - số lần nhắc lại.
Ví dụ: 5.4.3 - nghĩa là mẫu phân tích số 5; cấy ở nồng ñộ pha loãng thứ 4; cấy ở ñĩa môi trường có số lần nhắc lại thứ 3.
Sau khi cấy xong cho ñĩa, hoặc bình nuôi cấy vào trong tủ nuôi, nuôi ở nhiệt ñộ thích hợp cho từng chủng giống VSV khác nhau trong thời gian nhất ñịnh (có thể từ 48 - 72 giờ, có giống phải nuôi lâu hơn mới hình thành khuẩn lạc)
Cùng một dung dịch cơ chất pha loãng có thể phân tích nhiều mặt như nấm, xạ khuẩn và các loại vi khuẩn … bằng cách cấy vào môi trường thích hợp. Môi trường có thể là dịch thể, có thể là thạch bằng và từ những khuẩn lạc ñã mọc trên môi trường thạch bằng và những ñặc trưng của môi trường dịch thể, chúng ta có thể tính số lượng của vi sinh vật.