Xellulo, một hợp chất hữu cơ quan trọng nhất trong tự nhiên ñược quan tâm rất nhiều. Thực vật có chứa 4-70% xellulo. Sự phân giải xellulo bởi VSV sử dụng ít nhất 3 hệ thống enzym khác nhau (enzym nội bào β1-4- glucanaza, enzym ngoại bào β1-4- glucanaza, β1-4- glucosidaza). Nấm (ví dụ Chaetomium,
Fusarium, Polyporaceae, Poriaceae), vi khuẩn (Pseudomonas,…), xạ khuẩn (Actinomycetes…) là các loài hảo khí phân giải xellulo quan trọng nhất. Trong ñiều kiện yếm khí, xelluloza bị thuỷ phân bởi vi khuẩn thuộc giống
Clostridium. Sự phân giải của xelluloza ngoại bào kết thúc với xellobioza. Trong enzym ñất, việc xác ñịnh hoạt ñộng của xellulaza từ xellulo tự nhiên không hoà tan trong nước là rất khó. Cacboxy methyl xelluloza (CM- xelluloza) xử lý trước ñó vì thế thường ñược sử dụng. Giống như xác ñịnh hoạt tính của xylanaza và invertaza, hoạt tính xellulaza ñược xác ñịnh từ các ñường ñược giải phóng.
Sử dụng CM-xelluloza là chất nền, mẫu ñất ñược ủ ở 50oC/24h và pH=5,5. Việc giảm lượng ñường ñược giải phóng ra trong quá trình ủ gây ra sự biến ñổi Kali hexacyanoferrate (III) trong dung dịch kiềm. Kali hexacyanoferrate (II) phản ứng với ferric (NH4)2SO4 trong dung dịch axit tạo thành phức hợp feric hexacyanoferrate (II) (phổ màu xanh) ñược xác ñịnh bằng máy so màu (theo Schinner và von Mersi, 1990).
1. Vật liệu, hoá chất
- ðệm axetat 2M, pH=5,5: Hoà tan 164,06g CH3COONa khan/l, pha loãng 60ml axit axetic ñóng băng trong 500 ml. Trộn 1000 ml CH3COONa với 190ml axit axetic pha loãng, ñiều chỉnh ñến pH = 5,5.
- Dung dịch nền (0,7% theo khối lượng): 7g CMC-Na/1000ml ñệm axetat, khuấy trên máy khuấy từ ở 45oC/2h.
- Thuốc thử A: 16g Na2CO3 và 0,9g KCN/1000ml.
- Thuốc thử B: 0,5g Kali hexacyanoferrate (III)/1000ml, giữ trong lọ tối màu. - Thuốc thử C: 1,5g ferric amonium sulfat + 1g Natri dodecyl sulfat trong 900ml nước cất, thêm 4,2ml H2SO4 ñặc, hoà tan ở 50oC. Sau khi làm nguội, lên thể tích ñến 1000 ml.
- Dung dịch tiêu chuẩn ñậm ñặc (250 àg glucoza/ml): 0,25g glucoza khan/1000ml
- Dung dịch tiêu chuẩn làm việc (25 àg glucoza/ml): 10 ml dung dịch tiêu chuẩn mẹ/100 ml.
2. Thủ tục tiến hành
- Cân 10g ñất ẩm vào 3 bình nón 100ml. Thêm 15ml dung dịch chất nền và 15 ml ñệm axetat vào 2 bình (mẫu), cho 15ml ñệm axetat vào bình còn lại (ñối chứng). Lắc nhẹ các bình, ñánh dấu, ñậy nút và ủ ở 50oC/24h.
- Sau khi ủ, nhỏ 15ml huyễn dịch chất nền vào bình ñối chứng, lắc nhẹ, lọc các bình mẫu và ñối chứng ngay. Pha loãng 0,5ml dịch lọc tới 20ml trong ống nghiệm.
- ðể so màu, nhỏ 1ml dịch nền, 1ml thuốc thử A và 1ml thuốc thử B vào ống nghiệm, ñánh dấu, trộn ñều và ủ 15 phút trong chậu nước sôi.
- Sau khi làm nguội trong chậu nước ở nhiệt ñộ phòng 5 phút, thêm 5ml thuốc thử C, trộn và ñể lắng 60 phút ở nhiệt ñộ phòng cho phát triển màu. Trong vòng sau 30 phút, ño ở 690 nm trên máy quang phổ hấp phụ dựa vào phản ứng ñối chứng trắng.
- ðể chuẩn bị ñường cong hiệu giá chuẩn, hút 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 và 0,6 ml dung dịch làm việc tiêu chuẩn vào 7 ống thử và pha loãng ñến 1ml bằng nước cất. Xử lý các dung dịch này giống như lọc ñất. Các dung dịch chuẩn hiệu chỉnh chứa 0; 2,5; 5,0; 7,5; 10; 12,5 và 15 àg glucoza.
3. Tính kết quả
Hoạt tính CM-xellulaza ñược chỉ ra là tương ñương àg glucoza trên 1g vật chất khô và thời gian ủ. Lượng glucoza ñược tính từ ñường cong chuẩn.
(S-C).30.40.100
= µg GE.g-1 dm.24h-1
10.% dm
S: Giá trị ño mẫu (µg GE)
C: ðối chứng (µg GE)
30: Lượng hỗn hợp ủ (ml)
40: Hệ số pha loãng dịch lọc (ml) 10: Lượng ñất ban ñầu (g)
100%-1dm: Hệ số ñất khô