Tầm quan trọng của photphataza ñối với dinh dưỡng của cây trồng ñã ñược nhấn mạnh nhiều lần (Cosgrove 1967, Hayman 1975, Speir 1978, Dick và Tabatabai 1987,…). Trong hầu hết các loại ñất, sự phân chia photpho hữu cơ cao hơn photpho vô cơ. Trong các este của axit photpho hữu cơ, sự phân chia lớn nhất ở trong ñất là axit phytanic hoặc phytin. Photpho ñược hấp thụ bởi cây trồng ñòi hỏi sự khoáng hoá photpho hữu cơ bởi men photphataza thành photphat mạch thẳng. Photphataza bao gồm các enzym ñược sinh ra nhiều trong ñiều kiện lân dễ tiêu thấp. Photphataza ñược bài tiết ra từ rễ cây trồng và VSV. Photphataza của VSV trội hơn ở trong ñất.
Tên photphataza miêu tả một nhóm enzym thuỷ phân este cũng như andehit của axit photphoric. Có nhiều loại photphataza ở trong ñất.
ðể xác ñịnh hoạt tính photphataza, có thể sử dụng hoặc photphat ñựơc sinh ra trong quá trình khoáng hoá các este photphat hữu cơ tự nhiên hoặc các
thành phần hữu cơ sau khi khoáng hoá các vật chất hữu cơ nhân tạo (ví dụ βnaphtylphotphat, phenylphotphat,…)
Enzym photphomonoesteraza (còn gọi là photphataza) khác nhau trong các cơ chất ñặc trưng và pH tối thích của nó. Vì vậy, một trong những sự khác biệt là giữa photphataza kiềm và axit trong ñất. Photphodiesteraza phân huỷ các axit nucleic và ñựơc tìm thấy ở trong cây trồng, ñộng vật và vi sinh vật. Hoạt ñộng của Photphotriesteraza chỉ mới ñược phát hiện năm 1976, nhưng chưa ñược quan tâm nhiều. Hoạt ñộng của polyphophataza ñược quan tâm ñặc biệt khi ñược ngưng tụ, photphat vô cơ ñược sử dụng như phân bón cung cấp lân.
Sau khi thêm vào dung dịch phenylphotphat (muối Natri), mẫu ñất ñược ủ ở 37oC/3h. Phenol ñược giải phóng chuyển màu với 2,6 dibromchinone clorit và ñược xác ñịnh ở bước sóng 614nm (theo phương pháp cải tiến từ phương pháp của Hoffmann, 1986).
1. Vật liệu, hoá chất
- Dung dịch nền 0,1 M: 27g Natri phenyl photphat/1000ml nước cất - ðệm axetat (pH=5):
+ Dung dịch 1: 60ml axit axetic ñóng băng/1000ml nước cất + Dung dịch 2: 136g Natri axetat/1000ml nước cất
Trộn dung dịch 1 và 2 theo tỉ lệ 1:2 và ñiều chỉnh pH ñến 5
- ðệm xitrat (pH=7): 300g trinatri xitrat/1000 ml, ñiều chỉnh pH bằng HCl - ðệm boric (pH=10): 12,4 g H3BO3/100ml NaOH 1M, lên thể tích 1000ml. - Thuốc thử màu: 200mg 2,6 dibromchinone clorit/100ml etanol (60%v/v) - Dung dịch chuẩn mẹ (1mg phenol/ml): 1g phenol/1000ml, giữ trong lọ màu. - Dung dịch chuẩn làm việc (10µg phenol/ml): pha loãng 10ml dịch mẹ/1000ml
- Dãy dung dịch chuẩn hiệu giá: Hút 0; 5;10; 15 và 20 ml dung dịch chuẩn (10µg phenol/ml) vào 5 bình nón 100ml, thêm 5ml dung dịch ñệm mong muốn, 1ml thuuốc thử màu và 25ml nước cất. Sau 30 phút, lên thể tích với nước cất, trộn ñều. Dãy chuẩn chứa 0,50, 100, 150 và 200 µg phenol.
2. Thủ tục tiến hành
- Cho 5g ñất ẩm vào 4 bình nón 50ml, hút vào 10ml ñệm axetat, citrat hoặc boric vào mỗi bình.
- Thêm 5ml dung dịch chất nền vào 3 bình (mẫu), lấy 5ml cho vào bình còn lại (ñối chứng), lắc nhẹ, ñậy nút và ủ ở 37oC/3h.
- Sau khi ủ, lên thể tích, lắc ñều và lọc vào các ống nghiệm.
- Hút 2 ml dịch lọc (phụ thuộc vào hoạt tính của ñất, lượng dịch lọc có thể thay ñổi từ 1-4ml) vào bình ñịnh mức 100ml chứa 5ml ñệm boric. Thêm 1ml
Sau ñó, lên thể tích và trộn ñều. ðo mật ñộ màu của dãy chuẩn, mẫu và ñối chứng trên máy quang phổ hấp phụ ở 614nm dựa vào phản ứng ñối chứng trắng trong vòng 24h.
3. Tính kết quả
Hoạt tính photphataza ñược biểu thị là µg phenol trên 1g chất khô và thời gian ủ. Nồng ñộ phenol của mẫu và ñối chứng ñược tính từ ñường cong chuẩn.
(S-C).50.100
= µg phenol.g-1 dm.3h-1 ml.5.% dm
S: Giá trị ño mẫu (µg phenol)
C: ðối chứng (µg phenol)
50: Lượng chiết xuất (ml) ml: ước số dịch lọc (ml)
5: Lượng ñất ban ñầu (g)
100%-1dm: Hệ số ñất khô