II. CHUẨN BỊ CÁC MÔI TRƯỜNG ðỂ NUÔI CẤY VI SINH VẬT
4. Chuẩn bị môi trường
Cần ựọc kỹ công thức cấu tạo môi trường, chuẩn bị các hoá chất và dụng cụ liên quan
4.1. Pha chế
Nhìn vào các công thức môi trường, lần lượt cân ựong các thành phần. đánh dấu vào công thức các thành phần ựã cân hoặc ựong. Nếu công thức có thạch thì nên ựong nước cho vào nồi ựựng, cân thạch cho vào nước ựể thạch ngấm dễ tan khi ựược ựun sôi và lần lượt cân ựong các thành phần khác.
Nếu môi trường phải ựun nấu, ngoài thể tắch nước theo công thức nên bổ sung một lượng nhỏ nước ựể bù lại thể tắch bay hơi khi ựun (khoảng 15-20ml/l)
Mỗi hoá chất xúc bằng một thìa riêng khi cân. Cho hoá chất hoặc các thành phần ựược cân lên ựĩa có giấy cân một cách từ từ tới khi vừa ựủ. Nắm vững cách sử dụng các loại cân.
Với các thành phần có hàm lượng nhỏ nên pha dung dịch mẹ (stock solution), tắnh hàm lượng có trong 1 ựơn vị thể tắch suy ra thể tắch cần lấy ựể bổ sung vào môi trường.
Các loại bột gạo, ngô, cám ựược cân và cho vào nước lạnh, vừa ựun vừa khuấy cho tới khi bột chắn.
Các thành phần kém bền nhiệt như chất kháng sinh, vitaminẦphải ựược khử trùng theo phương pháp riêng (thường sử dụng màng lọc khuẩn)
đôi khi một số thành phần ựược cân riêng, khử trùng riêng và chỉ ựược trộn lại với nhau sau khi ựã khử trùng ựể tránh phản ứng tạo thành kết tủa khi toàn bộ thành phần ựược khử trùng chung (xảy ra khi có mặt ựồng thời các muối phôtphat và MgSO4).
4.2. đun môi trường
Môi trường dịch thể: Nếu các thành phần tan ựều trong nước thì không cần ựun.
Môi trường ựặc: đặt nồi lên bếp vừa ựun vừa khuấy ựều bằng ựũa thuỷ tinh. Khi môi trường sôi một lúc, thạch tan hết là ựược, tránh ựun lâu nước bay hơi sẽ làm cạn môi trường. Hớt bọt hoặc lọc trong nếu cần.
4.3. điều chỉnh pH
Nếu môi trường ở dạng dịch thể trong suốt, không màu không chứa các chất dắnh nhớt như tinh bột, có thể ựo pH bằng máy ựo.
Môi trường có màu, chứa các chất dắnh nhớt không ựược ựo pH bằng máy (ựiện cực dễ bị hỏng), nên sử dụng giấy ựo pH. Cũng có thể nhận biết pH qua màu sắc của môi trường do các chất chỉ thị màu tạo nên.
Nhìn chung, nếu các thành phần môi trường ựược cân ựong chắnh xác, các hoá chất ựạt tiêu chuẩn, sau khi pha chế môi trường sẽ ựạt ựược giá trị pH cần có. Nếu pH sai lệnh quá lớn cần xem lại các khâu và phải pha lại môi trường. Nếu sai khác không lớn, có thể ựiều chỉnh bằng dung dịch kiềm (KOH, NaOH) hoặc axit (HCl,CH3COOH) loãng hoặc các muối theo chỉ dẫn ở công thức. Việc ựiều chỉnh pH cần thận trọng ựể sau khi chỉnh xong thể tắch môi trường không bị thay ựổi ngoài phạm vi cho phép.
* Lưu ý: Khi pH môi trường thấp hơn 6,0 - 6,5 thì sẽ xảy ta việc pepton hoá gelatin và sau khi khử trùng, môi trường sẽ không ựông lại ựược. Khi pH thấp hơn 5,0 sẽ xảy ra sự thuỷ phân và thạch mất khả năng tạo gel.
Nếu môi trường có phản ứng kiềm thì khi khử trùng sẽ xuất hiện kết tủa sắt, xuất hiện việc caramen hoá ựường và ựường trở nên không hấp thu ựược ựối với vi sinh vật. để tránh những hiện tượng này, các môi trường ựược dùng ựể nuôi cấy các vi sinh vật ưa axit hoặc ưa kiềm phải ựược tiến hành khử trùng ở pH trung tắnh và sau khi hấp áp lực mới axit hoá hoặc kiềm hoá môi trường. Ngoài ra có nhiều thành phần của môi trường thường ựược khử trùng riêng ở những chế ựộ pH không ảnh hưởng tới chúng, sau ựó mới ựưa vào môi trường một cách vô trùng với số lượng thắch hợp.
Sau khi khử trùng, pH môi trường có thể bị thay ựổi ựôi khi phải kiểm tra lại.
4.4. Phân phối môi trường vào các dụng cụ
Dụng cụ ựược dùng phải vô trùng. để khử trùng tốt, môi trường chỉ ựược rót tới 1/2 dung tắch của vật chứa. Với các ống nghiệm làm thạch nghiêng chỉ rót khoảng 1/4 chiều cao ống và 1/2 với ống làm thạch ựứng.
Lớp môi trường càng dầy việc tiệt trùng càng khó, hơn nữa ở áp lực cao môi trường sẽ sôi mạnh làm ựẩy nút và phụt ra ngoài.
đối với các bình dùng ựể nuôi VSV hiếu khắ trên máy lắc chỉ rót khoảng 1/5 dung tắch bình. đối với bình dùng nuôi kị khắ, sau khi khử trùng dồn một số bình lại với nhau trong ựiều kiện vô trùng ựể ựạt ựược thể tắch cần thiết.