III. MÔI TRƯỜNG CHUYÊN TÍNH
1. Trao ñổ i Cacbon
Các phản ứng hoá học giải phóng ra năng lượng từ sự phân giải các phân tử hữu cơ phức tạp ñược gọi là dị hoá. Hầu hết VSV chuyển hoá hydratcacbon giải phóng CO2 và năng lượng. Hydratcacbon là các phân tử hữu cơ có chứa cacbon, hydro và oxy theo tỉ lệ (CH2O)n. Hydratcacbon có thể chia thành 3 nhóm dựa vào số lượng: monosaccharit, disaccharit và polysaccharit. Monosaccharit là loại ñường ñơn có chứa từ 3-7 nguyên tử cacbon, disaccharit
ñược tạo nên từ 2 ñơn phân tử monosaccharit, và polysaccharit bao gồm 8 hoặc nhiều hơn các phân tử monosaccharit.
Enzim ngoại bào là enzim thuỷ phân chính bên ngoài tế bào, và phá vỡ các vật chất lớn khi có thêm nước thành các thành phần nhỏ hơn mà chúng có thể chuyển vận vào trong tế bào. Enzim ngoại bào Amilaza thuỷ phân polysaccharit, tinh bột thành các hydratcacbon nhỏ hơn. Glucoza, một loại monosaccharit có thể ñược tạo ra do thủy phân. Trong phòng thí nghiệm, sự có mặt của các enzim ngoại bào ñược xác ñịnh bằng cách quan sát sự thay ñổi cơ chất bên ngoài khuẩn lạc vi sinh vật.
Glucoza có thể vào bên trong tế bào và ñược dị hoá; một số vi khuẩn dị hoá oxy hoá glucoza tạo thành oxit cacbon và nước. Dị hoá oxi hoá ñòi hỏi phải có mặt phân tử oxy (O2). Tuy nhiên, hầu hết vi khuẩn lên men glucoza mà không sử dụng oxy. Dị hoá lên men không yêu cầu oxy nhưng có thể xảy ra trong ñiều kiện có oxy. Sản phẩm trao ñổi chất cuối cùng của quá trình lên men là các phân tử hữu cơ nhỏ, thường là các axit hữu cơ. Một số vi khuẩn vừa oxy hoá vừa lên men, một số khác không thực hiện cả oxy hoá và lên men nhưng lại lấy cacbon và năng lượng từ các phương thức khác.
Một sinh vật bị oxy hoá hoặc lên men có thể ñược xác ñịnh bằng cách sử dụng môi trường cơ bản OF của Rudolph Hugh và Einar Leifson với loại hydratcacbon mong muốn ñược thêm vào. Môi trường OF là môi trường dinh dưỡng thạch sâu bán rắn chứa nồng ñộ hydratcacbon cao và nồng ñộ pepton thấp. Pepton sẽ hỗ trợ một phần sự sinh trưởng của các vi khuẩn không oxy hoá và không lên men. Hai ống nghiệm ñược sử dụng: một ống mở ñể lấy không khí và một ống bịt kín ñể giữ không có oxy. Môi trường OF chứa chỉ thị xanh bromthymol, sẽ trở thành màu vàng khi có mặt axit, chứng tỏ xảy ra dị hoá cacbon. Trong ñiều kiện có alkan, sẽ sử dụng pepton và không dùng hydratcacbon ñược biểu lộ bằng màu xanh sẫm. Nếu hydratcacbon ñược chuyển hoá trong cả 2 ống, sự lên men ñã xảy ra. Một số vi khuẩn sinh ra khí trong quá trình lên men các hydratcacbon. Một cơ thể chỉ sử dụng oxy hoá hydratcacbon sẽ chỉ sinh ra axit trong ống nghiệm mở. Môi trường OF ñược sử dụng ñể xác ñịnh sự dị hoá cacbon của vi khuẩn Gram âm Bacillus. Sự dị hoá cacbon sẽ ñược chứng minh trong bài tập này. Các test thử sẽ rất quan trọng trong việc xác ñịnh vi khuẩn.
1.1. Vật liệu
ðĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng thạch - tinh bột Môi trường thạch sâu gluco-OF
Dầu khoáng
Thuốc nhuộm Gram
1.2. Dịch nuôi cấy
Bacillus subtilis Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
1.3. Thủ tục kỹ thuật yêu cầu 1.3.1. Thuỷ phân tinh bột 1.3.1. Thuỷ phân tinh bột
a. ðeo khẩu trang, chia môi trường thạch-tinh bột thành 3 phần bằng cách ñánh dấu dưới ñáy ñĩa.
b. Cấy ria một ñường ñơn vi khuẩn Bacillus, Escherichia, Pseudomonas
trên mỗi phần.
c. ðặt ngược các ñĩa nuôi ở 35oC/24h. Sau khi sự sinh trưởng diễn ra, các ñĩa có thể ñược cất trữ trong tủ lạnh ở 5oC tới giai ñoạn thí nghiệm tiếp theo.
d. Ghi lại bất kỳ sự phát triển nào của vi sinh vật, sau ñó ñổ tràn Indon Gram lên ñĩa. Khu vực thuỷ phân tinh bột sẽ hiện rõ, trong khi khu vực tinh bột không chuyển hoá sẽ nhuộm màu xanh sẫm.
1.3.2. Môi trường OF
a. Sử dụng que cấy thẳng, nhiễm 2 ống môi trường glucoza-OF với dịch nuôi cấy vi khuẩn ñã chỉ ñịnh (Escherichia, Pseudomonas hoặc Alcaligenes).
b. Nhỏ khoảng 5ml dịch dầu khoáng trên 1 ống môi trường. ðậy nút lại. c. Nuôi tất cả các ống ở 35oC cho tới giai ñoạn thí nghiệm tiếp theo.
d. So sánh các ống môi trường nhiễm và không nhiễm VSV. Ghi lại kết quả như sau: khuẩn lạc có mọc hay không, liệu glucoza ñã ñược sử dụng? Và loại trao ñổi chất?
Sự di ñộng của vi khuẩn có thể xác ñịnh từ các ống môi trường OF.
e. Quan sát và ghi lại kết quả các loại VSV mà bạn không nuôi cấy (nhìn màu sắc ñĩa nuôi cấy).