Hỡnh 5.2: Sơ đồ cường độ hụ hấp qua cỏc thời ký phỏt triển của rau quả
5.3.5 Phương phỏp nuụi cấy
Để thu nhận enzim từ vi sinh vật, chỳng ta cú thể nuụi cấy theo phương phỏp bề mặt trờn mụi trường rắn hoặc theo phương phỏp chiều sõu trong mụi trường lỏng.
Dưới đõy chỳng tụi xin giới thiệu 2 phương phỏp nuụi cấy bề mặt và bề sõu với mục đớch thu nhận chế phẩm amylaza từ nấm mốc.
a) Nuụi cấy nấm mốc theo phương phỏp bề mặt gồm cỏc giai đoạn sau :
1) Chuẩn bị phối liệu : nguyờn liệu dựng để nuụi cấy cú thể là bột ngụ, cỏm gạo, vỏ trấu, vỏ lạc và chuẩn bị phối chế theo cỏc tỉ lệ sau :
Bột ngụ 70 ữ 80% Trấu nhỏ 20 ữ 30% Cỏm gạo 80 ữ 90% Trấu nhỏ 20 ữ10% Cỏm gạo 85 ữ95% Bột ngụ 15 ữ 5% Cỏm gạo 100%
Tựy theo chất lượng của nguyờn liệu ta cú thể chọn tỉ lệ nào tựy ý miễn là bảo đảm nhận được chế phẩm cú hoạt độ cao. Ngoài ra cú thể nghiờn cứu cho thờm vỏ lạc, khụ đậu tương v.v..
Dựa vào khối lượng cần hấp cho mỗi lần, lượng nước được đưa vào chiếm 50 ữ 60 lớt/100kg.
2) Hấp phối liệu : sau khi trộn đều ta đưa phối liệu vào nồi hấp nhằm 2 mục đớch sau: hấp chớn nguyờn liệu và tiệt trựng. Thời gian hấp kộo dài 3,4 ữ4 giờ nếu tiến hành ở ỏp suất thường và 2 giờ nếu ỏp suất 2kg/cm2. nguyờn liệu chớn phải cú mựi thơm nhẹ dễ chịu. Tiếp theo đem vũ tơi và làm nguội tới 34 ữ 35oC rồi trộn giống vào tựy theo chất lượng của nấm giống tỉ lệ đưa vào cú thể từ 0,2 đến 1%.
3) Trộn giống: cú thể tiến hành theo nhiều kiểu khỏc nhau. Trộn giống với ớt mụi trường, sau đú lại trộn đều với lượng mụi trường lớn hơn và cứ thế tiếp tục. Khụng nờn trộn giống vào toàn bộ mụi trường cựng một lỳc vỡ dễ khụng đều. Tốt hơn là hũa giống vào nước đun sụi để nguội sau đú vẩy đều vào mụi trường. Biện phỏp này giỳp bào tử hỳt nước và sẽ nhanh phỏt triển khi đưa vào phũng nuụi mà khụng cần ủ đống.
Tốt nhất là hũa nấm giống vào dung dịch axit clohydric cú nồng độ 0,1N. để yờn khoảng 30 phỳt để diệt tạp khuẩn sau đú vẫy vào mụi trường và trộn đều.
4) Tải canh trường vào mành, mành phải được vệ sinh, thanh trựng và để rỏo nước. Khi tải canh trường lờn mành cần cố gắng giữ vệ sinh, hạn chế khả năng nhiểm khuẩn do chõn tay và dụng cụ. Chiều dầy canh trường phải đều và nờn vào khoảng 3cm vào mựa đụng và 2cm vào mựa hố. Xung quanh mộp mành nờn vun dầy hơn để đỡ bị khụ.
5) Phũng nuụi mốc : tựy thuộc năng suất và cỏch bồ trớ sản xuất của xớ nghiệp, phũng nuụi cú thể khỏc nhau, chiều cao nờn từ 3 đến 3,5m. nếu phũng nuụi được cung cấp khụng khớ lạnh
159 và ẩm thỡ khụng nhất thiết phải để cửa sổ nhưng phải cú ống dẫn và phõn phối khụng khớ vào và ra. Nếu khụng cú điều kiện trờn thỡ phũng nuụi cần bố trớ ống phun nước quanh tường để mựa hố phun nước lạnh, màu đụng phun nước ấm nhằm giữ và điều chỉnh nhiệt độ cựng độ ẩm của phũng.
Giỏ đặt mành nờn cú chiều cao vừa phải dễ thao tỏc. Chiều cao giữa cỏc mành nờn khoảng 0,2m. mỗi giỏ đặt 6 ữ 7 mành là vừa. Tổng chiều cao của giỏ đặt mành 1,6 ữ 1,7m.
Thời gian phỏt triển của nấm chia thành ba giai đoạn :
Giai đoạn đầu bào tử phỏt triển chậm, nhiệt độ chưa tăng. Mựa đụng cần chỳ ý giữ ẩm và ấm để nấm mốc sớm phỏt triển. Lượng khụng khớ cần trao đổi chỉ 4 ữ lần thể tớch phũng nuụi.
Giai đoạn hai đặc trưng cho phỏt triển mạnh, tỏa nhiều nhiệt. Nhiệt độ canh trường cú thể tăng tới 40oC và hơn nữa. Nếu khụng thải nhiệt kịp thời sẽ ảnh hưởng xấu đến tớch tụ enzim. Cần tăng cường khụng khớ lạnh và ẩm để duy trỡ nhiệt độ, cung cấp oxy giữ cho nấm phỏt triển bỡnh thường. Sau 20 ữ 24 giờ nấm tạo sợi nhiều, canh trường liờn kết thành mảng lớn, cần dựng que vụ trựng lật dưới lờn trờn, tạo điều kiện tỏa nhiệt tốt. Chỳ ý đừng làm nấm cỡ thành từng miếng bộ – gõy tổn thương nhiều đến phỏt triển của sợi nấm.
Giai đoạn ba nấm phỏt triển chậm dần, tỏa nhiệt giảm nhưng enzim vẫn được tớch tụ tiếp và đạt cao ở cuối giai đoạn khi trờn mặt nấm xuất hiện lơ thơ cỏc bào tử . nếu kộo dài dễ bào tử mọc nhiều sẽ làm giảm hoạt độ của chế phẩm. Khi kết thỳc chu kỡ nuụi cấy chế phẩm được vũ tơi hoặc nghiền nhỏ, cú thể dựng ngay để đường húa tinh bột hoặc đem sấy ở nhiệt độ 40 ữ
45oC tới độ ẩm 8 ữ 10% rồi đưa đi bảo quản. Mặt khỏc người ta dựng nước hặc dung mụi để trớch ly enzim khỏi canh trường. Sau đú đem cụ chõn khụng dựng húa chất để kết tủa và làm sạch tới mức độ khỏc nhau tựy theo mức độ sử dụng.
b) Nuụi cấy trong mụi trường lỏng :
So với phương phỏp nuụi cấy bề mặt, phương phỏp bề sõu cú ưu điểm là tốn ớt diện tớch, dễ tự động húa và cơ giới húa, lao động đỡ vất vả và cho năng suất cao. Điều quan trọng là cú thể dựng nước bó rượu làm canh trường nuụi cấy, tiết kiệm được nguyờn liệu. Mặt khỏc nuụi cấy song enzim chủ yếu nằm trong chất lỏng. Do đú khụng cần phải khấu trớch ly hoặc sấy như khi nuụi cấy theo phương phỏp bề mặt.
Bờn cạnh cỏc ưu điểm kể trờn, phương phỏp này cũng cú những khú khăn và nhược điểm : dễ bị nhiểm hàng loạt nhất là ở điều kiện nhiệt đới như là ở nước ta và kĩ thuật cũn ở trỡnh độ thấp. Khú khăn cơ bản là vấn đề sục khớ nhằm cung cấp oxy cho phỏt triển của nấm. Nếu khụng giải quyết tốt vấn đề sục khớ thỡ hoạt độ chế phẩm sẽ thấp, tiờu tốn năng lượng nhiều. Trong tỡnh hỡnh cung cấp điện khụng ổn định thỡ nuụi cấy trong mụi trường lỏng khú đạt hiệu quả so với phương phỏp bề mặt.
Mặc dự cú những khú khăn và nhược điểm kể trờn, phương phỏp bề sõu vẫn mang nhiều tớnh chất ưu việt của nú. Vỡ thế chỳng ta cần nghiờn cứu một cỏch nghiờm tỳc và toàn diện, trỏnh đơn giản húa, khụng chỳ ý đến hiệu quả như cú nơi đó từng làm.
Mụi trường nuụi cấy chủ yếu là nước bó rượu tinh bột được lọc qua dõy cú đường kớnh 2mm. Tiếp đú cho thờm từ 1 đến 2% bột ngụ rồi dựng khoảng 0,2% oxytmagiờ hoặc phấn trung hũa tới pH 5,6 ữ 5,8. Sau đú đem tiệt trựng ở nhiệt độ 125 ữ 130oC trong 2 giờ rồi làm nguội tới 30 ữ 32oC nồng độ chất khụ của mụi trường phụ thuộc vào bó rượu cú thể từ 4 đến 6% hoặc hơn nữa. Chất khử 2 ữ 3%; đạm trung chiếm 220 ữ 280mg/100ml.
Làm lạnh xong cấy mốc giống vào với tỉ lệ 10% so với mụi trường .
Mụi trường nuụi giống cũng cú thành phần tường tự nhưng cú bổ sung thờm 0,5% cao ngụ dựng làm chất kớch thớch sinh trưởng. Thời gian nuụi kộo dài 20 ữ 36 giờ; cũn đối với mốc sản xuất thường là 3 ngày.
Khi nuụi mốc mụi trường phải sục khớ liờn tục với lượng 30 ữ 40m3/m3 mụi – giờ. Nếu kĩ thuật sục khớ tốt cú thể giảm tới 10 ữ 12m3/m3 giờ. ỏp suất thựng nuụi mốc 0,5 ati.
Khi nuụi cấy theo phương phỏp bề mặt cú thể dựng bột ngụ, cỏm gạo trộn với trấu nhỏ với tỉ lờ khỏc nhau.
Đối với nuụi cấy trong mụi trường lỏng dựng chủ yếu là nước bó rượu tinh bột, cú thờm bột ngụ khoảng 1 ữ 2% và trung hũa bằng MgO hoặc phấn với tỉ lệ 0,2%.
2. Chuẩn bị mụi trường.
Mụi trường bề mặt được trộn với nước theo tỉ lệ 50 ữ 60% rồi đem hấp chớn và tiết trựng ở ỏp suất thường 3,5 – 4 giờ hoặc 2 giờ ở ỏp suất 2kg/cm2.
Với mụi trường lỏng thỡ tiệt trựng trong 2 giờ ở ỏp suất 2kg/cm2 tiệt trựng xong mụi trường được làm nguội tới 30 ữ 32oC.
3. Trộn giống và nuụi cấy.
Nuụi cấy bề mặt giống chiếm 0,2 ữ1% Nuụi cấy sõu giống tới 10%.
Điều kiện nuụi : to = 30 ữ 32oC; pH 5,6 ữ 5,8 độ ẩm 55 ữ 60% đối với mụi trường rắn, với mụi trường lỏng nồng độ chất khụ 4 ữ 6%. Luụn sục khớ sạch vụ trựng vào mụi trường lỏng và quạt khụng khớ lạnh ẩm vào phũng nuụi theo phương phỏp bề mặt W = 95 ữ 98%; t = 26 ữ
28 oC,
Thời gian nuụi: 30 ữ 40 giờ - bề mặt 65 ữ 72 giờ - bề sõu 4. Xử lý
- Nghiền và đem sử dụng ngay hoặc đem sấy ở t = 40 ữ 50oC tới độ ẩm 8 ữ 10% - Trớch ly, kết tủa, cụ đặc v.v..
5. Bảo quản ở điều kiện 5 ữ 6oC.