ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần và sự phân bố của các loài giun sán; tỉ lệ và cường độ nhiễm giun sán ở gà
2.4.2.1 Mổ khám toàn diện để thu thập giun sán
* Phương pháp mổ khám toàn diện của Skrjabin K. I., Petrov A. M. (1963) [54].
- Gà sau khi làm chết, lột da và quan sát các tổ chức dưới da để tìm giun sán và ấu trùng giun sán.
- Mổ gà từ hậu môn đến hết xương ức để bộc lộ các nội quan trong xoang bụng, xoang ngực. Tách riêng các bộ phận của hệ tiêu hóa, bài tiết, sinh dục, tuần hoàn và hô hấp. Quan sát kỹ xoang ngực, xoang bụng tìm ấu trùng và lấy nước xoang cho vào đĩa petri để kiểm tra.
- Kiểm tra mắt: Dùng dao rạch hai bên khóe mắt, sau đó dùng kẹp để tách mắt, cho vào cốc hay đĩa petri bộc lộ thủy tinh thể, đồng thời dùng nước cất dội rửa nhiều lần xoang mắt cho vào cốc, bóp nát hai mắt, sau đó gạn rửa sa lắng nhiều lần, lấy cặn kiểm tra dưới kính hiển vi.
- Kiểm tra các cơ quan của gà: tách rời từng bộ phận gan, mật, thực quản, dạ dày cơ, dạ dày tuyến, ruột non, ruột già, manh tràng, thận, tử cung, túi Fabricius, cho riêng vào từng cốc, có nhãn ghi đầy đủ các thông tin về số hiệu gà, ngày mổ khám...
cho vào cốc, gạn lọc liên tục rồi lấy cặn kiểm tra dưới kính hiển vi.
- Dạ dày cơ: Cắt dọc theo chiều dài một bên, bóc lớp sừng bên trong để tìm giun sán, đổ chất chứa vào cốc, sau đó dùng phương pháp gạn rửa sa lắng nhiều lần để tìm giun sán.
- Thực quản, ruột non, ruột già, manh tràng… đều được kiểm tra riêng. Dùng kéo mũi nhọn cắt dọc theo thành ruột, quan sát bằng mắt và kính lúp, phát hiện và thu mẫu giun sán vào đĩa petri. Dùng lam kính nạo nhẹ niêm mạc cho vào cốc có chứa nước, gạn lọc sa lắng nhiều lần cho trong, lấy cặn kiểm tra dưới kính lúp để tìm và thu giun sán. Trong niêm mạc thực quản có thể quan sát thấy một số loài giun tròn.
- Hệ tuần hoàn: Cắt dọc tâm nhĩ thất, động mạch lớn để tìm giun sán.
- Các cơ quan nhu mô như gan, tụy, thận, tuyến sinh dục, tim, não, phổi… quan sát kỹ bề mặt, tìm ấu trùng sán dây. Dùng kéo cắt theo các động mạch của tim, gan, khí quản, phổi, tìm giun sán thu vào đĩa petri có sẵn dung dịch nước muối sinh lý. Dùng tay hoặc kẹp bóp nát từng cơ quan, gạn lọc liên tục đến khi trong, lấy cặn tìm giun sán. Dịch mật được gạn lọc nhiều lần để thu thập giun sán.
- Kiểm tra hệ tiết niệu, sinh dục: Kiểm tra buồng trứng, ống dẫn trứng, túi fabricius, túi tinh bằng cách cắt dọc theo nếp gấp để tìm giun sán.
2.4.2.2 Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu giun sán
- Theo Nguyễn Thị Lê và cs., (1996) [30]; Phạm Văn Khuê và Phan Lục (1996) [8], mẫu giun sán thu được đều định hình để bảo quản và định loại. Đối với sán lá, sán dây và giun đầu gai định hình trong cồn 700. Giun tròn định hình trong dung dịch Barbagallo.
- Đối với sán lá và sán dây để chết tự nhiên trong nước, thời gian từ 10 - 15 phút. Đối với sán có kích thước lớn cần ép giữa hai phiến kính trong dung dịch cồn 100 cho chết (khi ép sán dây, chỉ cần ép mỏng các đốt thân, còn đốt đầu không ép). Làm duỗi sán bằng phương pháp nước nóng (Sinclair và John, 1973) [80], chuyển sang các ống nghiệm có cồn 700 và ghi nhãn.
- Đối với giun tròn, để chết tự nhiên hoặc dùng nước ấm khoảng 500C để làm chết.
- Cách ghi nhãn:
2.4.2.3 Phương pháp bảo quản và làm tiêu bản mẫu giun sán
Làm chết giun sán và bảo quản tạm thời
- Các mẫu giun sán thu được theo từng số gà mổ khám, tách riêng từng lớp theo từng cơ quan, để ở đĩa lồng hoặc đĩa petri trong dung dịch nước sinh lý. Sán dây, sán lá và giun tròn làm chết bằng nước nóng 45 - 500 C. (Sinclair N. R. và John D. T., 1973) [93].
- Giun sán đã tách riêng từng lớp và cơ quan theo từng gà mổ khám, sau khi chết được bảo quản bằng cồn 70o hoặc dung dịch Barbagallo; đựng riêng trong ống nghiệm thủy tinh hoặc lọ thủy tinh nút mài, đậy kín và dán nhãn. Nhãn ghi đầy đủ các thông tin: Số gà mổ khám; ngày mổ khám; cơ quan nhiễm; số lượng cá thể giun hoặc sán lá, sán dây. Với mẫu có số lượng nhiều phải thay cồn hoặc dung dịch bảo quản 2 - 3 lần, mỗi lần cách nhau 2 - 3 ngày (để cồn đảm bảo nồng độ).
Làm tiêu bản tạm thời
(Để định loại giun tròn và một số loài sán lá, sán dây có số lượng nhiều, kích thước nhỏ hoặc trung bình).
- Đưa giun tròn hoặc những sán lá, sán dây nhỏ lên lam kính, nhỏ dung dịch làm trong (1 nước: 1glyxerin:1 axít lác tic). Định loại mẫu sau 12 h hoặc sau 24 h.
Làm tiêu bản cố định
Phương pháp nhuộm carmine axit (mẫu sán lá, sán dây sau khi đã ép mỏng)
- Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm carmine - axit clohidric (HCl): Lấy 5 g carmine nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 5 ml HCl và 5 ml nước cất, để yên sau 1 giờ, sau đó cho thêm 200 ml cồn 900, lắc đều, đậy nút bông, đun cách thuỷ cho tới khi carmine tan hết, để 1 ngày sau lọc. Dung dịch để sau 1 tuần mới dùng.
Sơ bộ định danh: Số lượng:
Vị trí ký sinh: Người lấy mẫu: Gà số:
Ngày tuổi: Khối lượng: Địa điểm lấy mẫu:
- Nhuộm mẫu trong carmine axit: Tuỳ thuộc vào độ lớn của mẫu mà thời gian mẫu để trong dung dịch nhuộm có thể từ 5 phút đến 1 giờ.
- Tẩy màu: Để tẩy bớt màu carmin, làm rõ cấu tạo chi tiết, mẫu phải chuyển
sang cồn - axit (100 ml cồn 800, thêm vào 2 - 3 giọt HCl) với thời gian từ 1 - 10 phút tuỳ thuộc vào độ lớn của mẫu. Sau đó rút nước trong cồn ở các nồng độ khác nhau: 800, 900, 1000, thời gian trong mỗi loại cồn từ 5 - 7 phút hoặc lâu hơn tuỳ thuộc vào kích thước của mẫu, mẫu có kích thước lớn thường để trong dung dịch lâu hơn.
- Làm mất nước: Sau đó làm trong mẫu bằng dung dịch xylen + cồn 1000 theo tỉ lệ 1:1 trong thời gian 1 - 2 phút.
- Lên tiêu bản: Nhỏ lên lam kính 1 - 2 giọt bom canada, đặt mẫu vào cho
ngay ngắn, nhỏ tiếp 1 giọt bom canada lên trên rồi đậy lamen lại. Để tiêu bản cố định cho tới khi bom canada khô. (Nguyễn Thị Lê và cs., 1996) [30].
Phương pháp đúc mẫu (mẫu giun tròn kích thước nhỏ và trung bình)
- Chuẩn bị dung dịch: Pha 3 loại dung dịch khác nhau bao gồm dung dịch 1
(cồn: glyxerin: nước cất; 20 ml: 1 ml: 79 ml). Dung dịch 2 (cồn: glyxerin; 5 ml: 95 ml); dung dịch 3 (cồn: glyxerin; 50 ml: 50 ml).
* Làm trong và làm mất nước mẫu:
- Làm mềm mẫu bằng cách để mẫu trong dung dịch nước sinh lý 10 - 30 phút. Chuyển mẫu sang dung dịch 1, chứa trong đĩa lồng, để 12 giờ trong tủ sấy nhiệt độ 380 - 400C.
- Chuyển mẫu sang đĩa lồng có chứa dung dịch 2, để 12 giờ trong tủ sấy nhiệt độ 380 - 400C. Chuyển mẫu sang đĩa lồng có chứa dung dịch 3, để 12 giờ trong tủ sấy nhiệt độ 380 - 400C.
- Làm khuôn đúc và lên tiêu bản: Parafin đun trên ngọn lửa đèn cồn cho đến
khi nóng chảy. Sau đó dùng ống inox đầu tròn nhúng vào dung dịch parafin rồi nhấc nhanh đặt lên lam kính tạo thành vòng parafin (lưu ý tất cả dụng cụ như: lam kính, lamen, kim nhọn đều phải đảm bảo sạch và vòng parafin nên đặt một phía của lam kính, phía còn lại để ghi thông tin mẫu).
* Lên tiêu bản:
- Dùng kim nhọn lấy mẫu giun đã được làm trong và mất nước đặt vào chính giữa vòng parafin, cho thêm 1 giọt glyxerin (lượng glyxerin tuỳ thuộc vào kích thước giun, cho đến khi bao phủ được toàn bộ mẫu).
- Đặt lamen lên trên rồi hơ trên tấm sắt bên dưới có đặt đèn cồn. Hơ lam kính mẫu cho đến khi parafin nóng chảy tràn đều lamen và cho những giọt bọt khí trôi ra ngoài. Sau khi đã hơ nóng, đặt tiêu bản trên mặt phẳng chờ cho parafin đông lại. Dùng chổi lông quét dọc theo viền lamen một lớp dung dịch (bom canada + xylen).
- Để tiêu bản trên mặt phẳng tới khi xlyen bay hơi thì tiêu bản đã đảm bảo và có thể sử dụng. (Nguyễn Thị Lê và cs., 1996) [30].
2.4.2.4 Phương pháp định loại các loài giun sán
- Định loại giun sán thu được theo khóa định loại của Skrjabin và Petrov (1963) [54]; Lapage (1968) [75]; Calnek et al (1991) [59].