2.3.2.1. Các phƣơng pháp phân tích vi sinh
Tổng số vi khuẩn probiotic
Xác định gián tiếp số lƣợng tế bào bằng cách đếm số lƣợng các khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng MRS-Agar. Đây là chỉ tiêu quan trọng của sản phẩm probiotic.
Mật độ vi khuẩn L.casei trong sản phẩm sữa chua.
Xác định gián tiếp số lƣợng tế bào L. casei bằng cách đếm số lƣợng các khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng chọn lọc MRS sorbitol agar [80].
2.3.2.2 Phân tích hóa sinh
Xác định pH 510.
Xác định lượng acid lactic sinh ra.
Tiến hành: chuẩn độ bằng dung dị chất c
phenolphthalein [6]
Xác đị : sử dụ AND, Mx-50.
Xác định hàm lượng cholesterol.
Tiến hành: định lƣợng cholesterol còn lại trong môi trƣờng nhƣ mô tả của Rudel‘ và c.s., (1973) [83].
- Ly tâm dịch vi khuẩn sau 20 giờ nuôi cấy, thu nhân dịch nổi.
- 1ml dịch nổi, thêm 1ml KOH (33%) và 2 ml ethanol, vortex, ủ 600C, 15 phút - Bổ sung 3ml hexane, vortex
- Thêm 2ml nƣớc cất, vortex
- Hút 1 ml lớp hexane chuyển vào ống nghiệm - Làm tan trong 2ml 0-phthalaldehyde, 10 phút - Thêm 0,5ml H2SO4, voretx 1 phút
- Đo OD 550 nm sau 60 phút
Đƣờng chuẩn xây dựng giá trị cholesterol tuyến tính với giá trị OD đã đƣợc xây dựng trƣớc đó.
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
54
Dựa vào giá trị OD ở trên. Thế vào phƣơng trình đƣờng chuẩn suy ra hàm lƣợng cholesterol hiện diện trong dung dịch sau 20 giờ nuôi cấy.
2.3.2.3. Phƣơng pháp đánh giá cảm quan
Dùng phƣơng pháp so hàng và phƣơng pháp cặp đôi để đánh giá cảm quan các sản phẩm sữa chua thu đƣợc. Các sản phẩm sữa chua đƣợc kí hiệu nhƣ sau:
Mẫu A: Mẫu sữa chua hoàn nguyên theo tỷ lệ 250g/l. Mẫu B: Mẫu sữa chua hoàn nguyên theo tỷ lệ 300g/l. Mẫu C: Mẫu sữa chua hoàn nguyên theo tỷ lệ 350g/l.
Mời 8 ngƣời cảm quan đã đƣợc sàng lọc sơ bộ về khả năng cảm quan, mỗi ngƣời đƣợc nhận 3 mẫu sữa chua đựng trong hũ thủy tinh có kí hiệu A, B, C đã đƣợc mã hóa trên hũ.
Đánh giá cảm quan theo phương pháp so hàng
Lập các phiếu chuẩn bị thí nghiệm, phiếu trả lời nhƣ phụ lục P10.
Đánh giá cảm quan theo phương pháp so sánh cặp
Lập các phiếu chuẩn bị thí nghiệm, phiếu trả lời nhƣ phụ lục P11.
2.3.2.4.
Tất cả các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên. Kết quả đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Minitab phiên bản 16.0. Sử dụng phƣơng pháp xử lý phân tích ANOVA 1 nhân tố; so sánh sự khác biệt các giá trị trung bình dựa trên phép kiểm định Tukey‘s HSD.
CHƯƠNG 3
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
55
3.1. KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN L. CASEI
3.1.1. Kiểm tra đặc tính sinh học của L. casei
3.1.1.1.
Kiểm tra các đặc điểm hình thái của vi khuẩn L. casei VTCC 186 ghi nhận đƣợc:
Đại thể: khuẩn lạc của L. casei có dạng hình tròn, bờ đều, màu trắng đục. Bề mặt khuẩn lạc hơi lồi, bóng, đƣờng kính từ 1-2 mm.
Vi thể: tế bào vi khuẩn L. casei có dạng hình que ngắn, không di động. Là vi khuẩn Gram (+), bắt màu tím của thuốc nhuộm Crystal violet. Có thể ở dạng tự do hoặc kết chuỗi ngắn. 3.1.1.2. L. casei [5] là . a b Hình 3.1. Hình dạng vi khuẩn L. casei a: Đại thể; b: Vi thể
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học 56 Từ hình 3.2 ghi nhận đƣợc: - 3 giờ ủ ảng 7,64 log (CFU/ml) (phụ lục P1).
- 18 giờ 3 giờ đ 21giờ). Vi khuẩn đã thích nghi đƣợc
với môi trƣờ 21giờ
9,33 log (CFU/ml) (phụ lục P1)
- 18 giờ 60 giờ khả
.
- Từ kết quả thu được, với mục đích thu sinh khối vi khuẩn L. casei VTCC 186 dùng để tạo chế phẩm vi gói, cũng như bổ sung vào sản phẩm sữa chua, chúng tôi chọn thời điểm lên men thu nhận sinh khối là 21giờ.
7.30 7.80 8.30 8.80 9.30 9.80 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
Thời gian (giờ)
L o g ( C F U /m l) Hình 3.2. L. casei
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
57
3.1.1.3. Khả năng lên men acid lactic của L. casei
L. casei thuộc giống Lactobacillus, do đó acid lactic là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men trao đổi chất [11]. Các acid lactic đƣợc sản xuất bởi L. casei thông qua quá trình lên men glucose là rất quan trọng vì acid lactic có chức năng giảm cholesterol, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch, chống bệnh tiêu chảy, tăng khả năng dung nạp lactose, ức chế tác nhân gây bệnh đƣờng ruột và đƣợc sử dụng nhƣ các chế phẩm sinh học [66]. Do đó, khả năng sinh acid lactic cũng là một chỉ tiêu quan trọng nhằm xác định đặc tính sinh học của đối tƣợng L. casei trong đề tài.
Tại thời điểm 0 giờ, lƣợng acid lactic trong môi trƣờng lên men hầu nhƣ bằng 0 (0,27 ± 0,27) và pH của môi trƣờng tƣơng đƣơng với mẫu đối chứng là 5,78 ± 0,02 (không cấy vi khuẩn L. casei) (bảng 3.1). Sau 24 giờ ủ ở 370C, lƣợng acid lactic sinh ra đáng kể (16,56 ± 0,62), làm pH của môi trƣờng giảm xuống đạt khoảng 3,64 ± 0,03. Lƣợng acid lactic sinh ra ổn định sau 48 giờ nuôi cấy (16,74 ± 0,31) và ở thời điểm 72 giờ là 16,89 ± 0,19 (bảng 3.1).
pH ĐC pH mẫu VNaOH ĐC VNaOHmẫu ∑a(g/l)
0 giờ 5,78 ± 0,02a 5,72 ± 0,02a 2,67±0,15a 2,97 ± 0,16b 0,27 ± 0,27b
24 giờ 5,76 ± 0,03a 3,64 ± 0,03b 2,93±0,06a 21,33 ± 0,58a 16,56 ± 0,62a
48 giờ 5,75 ± 0,02a 3,53 ± 0,02c 2,90±0,2a 21,50 ± 0,20a 16,74 ± 0,31a
72 giờ 5,78 ± 0,03a 3,49 ± 0,03c 2,90±0,01a 21,67 ± 0,21a 16,89 ± 0,19a
Kết quả được tính dựa trên giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n=3) abc
là giá trị trung bình cột, sự sai khác ký tự có ý nghĩa sai biệt về mặt thống kê (p<0,05) ĐC: đối chứng
Bảng 3.1. Giá trị đo pH, VNaOH và hàm lƣợng acid lactic ∑a(g/l) theo thời gian
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
58
Từ số liệu thực nghiệm chứng tỏ trong suốt giai đoạn tăng trưởng và phát triển, vi khuẩn L. casei VTCC 186 đã sản sinh ra acid lactic và chính lượng acid này đã làm cho pH của môi trường giảm xuống đáng kể sau 72 giờ nuôi cấy.
3.1.2. Khảo sát đặc tính probiotic của vi khuẩn L. casei
Để xác định tiềm năng probiotic thật sự của chủng L. casei sử dụng khi mật độ tế bào đã thỏa mãn theo tiêu chuẩn probiotic (>108 CFU/ml) của hiệp hội sữa chua quốc gia của mỹ (NYA) [60], chúng tôi đã tiến hành một số thí nghiệm in vitro về các đặc tính probiotic phù hợp cho ngƣời sử dụng gồm: khả năng chịu acid trong dịch dạ dày nhân tạo, chịu muối mật, khả năng tạo các hợp chất kháng khuẩn và giảm cholesterol.
3.1.2.1. Khả năng chịu pH thấp của dịch dạ dày
Các probiotic cho ngƣời sử dụng hiện nay đều đƣợc nghiên cứu đƣa vào cơ thể qua đƣờng tiêu hóa. Với khoảng 2 lít dịch vị đƣợc tiết mỗi ngày và pH rất thấp (khoảng pH từ 2-3), dạ dày tạo ra một hàng rào chống lại sự di chuyển vào ruột của các vi khuẩn [23]. Để có thể vƣợt qua đƣợc dạ dày, chủng probiotic phải có khả năng chịu đƣợc môi trƣờng khắc nghiệt của dịch vị bao gồm enzyme tiêu hóa và pH thấp này.
Từ hình 3.3 cho thấy môi trƣờng SGJ pH 2 và 2.5 ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng sống sót của L. casei. Tuy nhiên ở môi trƣờng SGJ pH 3, L. casei có thể thích nghi và phát triển ổn định.
Số liệu ở phụ lục P2 cho thấy, trong môi trƣờng SGJ với pH 2, với mật độ vi khuẩn ban đầu là 8,6 ± 0,1 log (CFU/ml), sau 30 và 60 phút số lƣợng tế bào sụt giảm nhanh chóng đạt tƣơng ứng với 5,43 ± 0,11 và 3,61 ± 0,14 log (CFU/ml). Tại thời điểm 90 phút, vi khuẩn L. casei chết hoàn toàn. Khả năng sống sót của L. casei khi xử lý SGJ với giá trị pH 2,5 cho kết quả không khác biệt so với SGJ với pH 2 (p>0,05). Khi giá trị pH của SGJ tăng lên 3, khả năng sống của L. casei không giảm và có xu hƣớng ổn định từ 8,59 ± 0,12 log (CFU/ml) ở giai đoạn đầu và giữ đƣợc mật độ ở 8,54 ± 0,02 log (CFU/ml) ở thời điểm 30 phút và tới thời điểm 60 phút mật độ tế bào có xu hƣớng
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
59
tăng và tiếp tục phát triển đến 120 phút khảo sát (8,91 ± 0,04 log (CFU/ml)). So sánh với nghiệm thức đối chứng (MRS pH=5,8), mật độ tế bào ở pH 3 hoàn toàn không khác biệt (p>0,05) về mặt thống kê (phụ lục P2).
Kết quả thực nghiệm cho kết quả tƣơng đồng với báo cáo của Mishra và c.s. (2005): tất cả 7 chủng L. casei đƣợc nghiên cứu đều có khả năng chịu đựng đƣợc pH 3 đến 3 giờ, trong đó có 3 chủng có khả năng chịu đựng đƣợc pH 2 đến 1 giờ [66].
Ngoài ra, nghiên cứu của Ashraf và c.s., (2009) ghi nhận SGJ tại pH 2 đƣợc xem là giá trị sàng lọc cho đặc tính probiotic đối với giống Lactobacillus. Bởi vì, với điều kiện này, các chủng L. acidophilus, L. delbrucekii, L. rhamnosus và L. salivarius
có sự giảm sút về mật độ tại thời điểm 90 phút từ 10 log (CFU/ml) xuống còn 5,67 ± 0,04; 5,76 ± 0,07; 4,92 ± 0,01; và 4,94 ± 0,04 log (CFU/ml) tƣơng ứng theo thứ tự liệt
pH
Hình 3.3. Khả năng sống sót của L. casei trong môi trƣờng SGJ với các giá trị pH khác nhau theo thời gian
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
60
kê. Trong khi đó L. paracasei rất nhạy cảm với điều kiện pH 2, chỉ còn (1,72 ± 0,04) log (CFU/ml) ở thời điểm 60 phút và chết hoàn toàn ở thời điểm 90 phút [10].
Khả năng sống sót của L. casei không còn ở thời điểm 90 phút trở đi với SGJ pH 2 và 2,5 có thể đƣợc giải thích rằng: khi môi trƣờng xung quanh tế bào ở dạng pH thấp dẫn đến pH nội bào có khuynh hƣớng hạ thấp, sự khác biệt pH màng giảm đáng kể và làm giảm động lực proton. Kết quả của hiện tƣợng này dẫn đến tế bào không thể tổng hợp ATP do mất đi khuynh độ hóa điện. Bên cạnh đó, quá trình acid hóa bên trong tế bào cũng làm giảm hoạt động của nhiều enzyme nhạy cảm với acid và dẫn đến rối loạn quá trình sinh tổng hợp DNA và protein [38]. Ngoài ra, theo Presser và c.s., (1997), hiện tƣợng tồn tại nhiều anion không liên kết của các acid hữu cơ cũng có thể gây ra việc liên kết ngẫu nhiên của nhiều phân tử diễn ra bên trong tế bào, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến hoạt động sinh lý của tế bào [77].
Từ các dữ liệu trên, chúng tôi kết luận rằng SJG pH 2 và 2,5 có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sống sót của L. casei VTCC 186. Tuy nhiên vi khuẩn này hoàn toàn chịu được môi trường SJG pH 3 suốt thời gian 120 phút khảo sát.
3.1.2.2. Khả năng chịu muối mật
Một thách thức khác đối với sự tồn tại của vi sinh vật trong đƣờng dạ dày – ruột của ngƣời là sự hiện diện của mật ở ruột non.
Muối mật đƣợc gan sản xuất từ quá trình chuyển hóa cholesterol [13]. Đối với sinh lý cơ thể ngƣời, nồng độ mật 0,3% đƣợc xem là nồng độ trung bình hiện diện ở ruột non [34]. Mật tham gia vào quá trình tiêu hóa không chỉ với chức năng phân cắt và hấp thụ chất béo, mà chúng còn có vai trò quan trọng, ngăn cản sự tồn tại của các vi sinh vật trong ruột [92]. Prieto và c.s., (2004) báo cáo rằng, nguyên nhân muối mật có thể gây hại cho các vi sinh vật là do chúng ngăn cản nhiều cơ chế bên trong tế bào bao gồm gây ra hiện tƣợng stress ở mức độ gen nhƣ quá trình sinh tổng hợp màng hay trong quá trình sửa chữa DNA của vi khuẩn [78]. Do đó, chủng probiotic cho ngƣời cần phải có khả năng kháng lại muối mật, để chúng có thể nhân lên cũng nhƣ có các
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
61
hoạt động trao đổi chất ổn định trong ruột non của vật chủ. Với nồng độ mật bò là 0,3%, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng chịu đựng muối mật của chủng L. casei.
Từ hình 3.4 cho thấy sức sống của vi khuẩn L. casei không bị ảnh hƣởng ở nồng độ muối mật 0,3% và có xu hƣớng tăng nhẹ. Ở thời điểm ban đầu là 8,67 ± 0,13 log (CFU/ml), mật độ của L. casei giữ nguyên không đổi ở thời điểm 1 giờ (8,67 ± 0,17 log (CFU/ml)) và có khuynh hƣớng tăng từ thời điểm 2 giờ (8,81 ± 0,15) đến thời điểm 4 giờ khảo sát (9,08 ± 0,17 log (CFU/ml)). So sánh kết quả của nghiệm thức có bổ sung muối mật với nghiệm thức đối chứng (môi trƣờng MRS không bổ sung muối mật) hoàn toàn không có sự khác biệt (p>0,05) (phụ lục P3).
Kết quả này tƣơng tự với kết quả đạt đƣợc bởi Mishra và c.s., (2005), các chủng
L. casei đƣợc nghiên cứu đều có khả năng chịu đựng đƣợc nồng độ mật lên đến 1 hoặc 2% [66]. Ngoài ra, nghiên cứu của Jacobsen và c.s., (1999) cũng cho rằng 46 chủng trong số 47 chủng Lactobacillus trong thí nghiệm của họ đều có khả năng chịu đựng đƣợc nồng độ mật là 0,3% [48].
Để giải thích cho khả năng kháng đƣợc muối mật của một số chủng vi khuẩn lactic, Cotter và c.s., (2003) báo cáo rằng: vi khuẩn có nhiều cách để điều khiển và hoạt
Hình 3.4. Khả năng sống sót của L. casei trong môi trƣờng có bổ sung muối mật theo thời gian
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
62
động chuyên biệt để loại bỏ những tác nhân gây stress tế bào [26]. Các tiểu phần của hệ thống ATPase F0F1 nội màng giúp đẩy nhanh quá trình bơm proton từ tế bào chất bởi lực đẩy proton. Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn có đƣợc những hệ thống chuyên biệt để loại thảy mật [14]. Các gen hoạt hóa hệ thống chuyên chở đặc biệt của L. acidophilus NCFM đƣợc xác định thuộc operon 2CRS (two-component regulatory systems: hệ thống điều hòa 2 thành phần). Operon 2CRS cho phép vi khuẩn nhận biết một cách nhanh chóng và đáp ứng lại sự thay đổi trong môi trƣờng sau khi nhận đƣợc tín hiệu từ màng do các thụ thể của Histidine Protein Kinase (HPK) dẫn truyền [89]. Hơn thế nữa, một số dòng vi khuẩn có những enzyme làm biến đổi cấu trúc của muối mật. Các enzyme thủy phân muối mật (Bile Salt Hydrolase: BSH) thông thƣờng là những enzyme nội bào xúc tác quá trình thủy phân các liên kết amide giữa steroid và chuỗi bên amino acid. Hoạt động của các enzyme này đƣợc tìm thấy trên các loài vi khuẩn có nguồn gốc từ hệ tiêu hóa động vật hữu nhũ nhƣ Bifidobacterium, L. acidophilus, L. gasseri và một số loài L. plantarum tuy nhiên lại không tìm thấy ở một số loài cũng phân lập từ môi trƣờng này nhƣ L. lactis, L. delbrueckii, L. helveticus, và
Streptococcus thermophilus [14]. Với những cơ chế nêu trên có thể chƣa là tất cả các cơ chế xảy ra ở vi khuẩn lactic, tuy nhiên cũng đã giải thích đƣợc nguyên nhân xảy ra hiện tƣợng kháng muối mật.
Kết quả thực nghiệm cho kết luận rằng: chủng vi khuẩn L. casei VTCC 186 có khả năng kháng được nồng độ muối mật là 0,3%.
3.1.2.3. Khả năng khử cholesterol
Nồng độ cholesterol tồn tại cao trong máu là nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh về tim mạch. Nhiều nghiên cứu cho thấy, việc tiêu thụ sản phẩm có chứa vi khuẩn lactic có thể giảm cholesterol trong huyết thanh, giúp ngăn ngừa bệnh tim mạch ở ngƣời. Gilliland và c.s., (1985) báo cáo rằng, khả năng khử cholesterol chỉ xảy ra khi chủng vi khuẩn Lactobacillus đƣợc phát triển trong môi trƣờng có sự hiện diện của muối mật [34]. Do đó, thí nghiệm in vitro về khả năng khử cholesterol của L. casei
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
63
trong môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung 0.3% muối mật đƣợc thực hiện, nhằm xác định có hay không có khả năng khử cholesterol của chủng L. casei này?
Một số nhà nghiên cứu phát hiện hiệu quả làm giảm mức cholesterol của vi khuẩn một phần nhờ hoạt tính của enzyme thủy phân muối mật (BSH). Những muối mật bị khử liên kết bởi BSH ít đƣợc tái hấp thu hơn là các muối mật không bị khử liên kết. Kết quả là các acid mật tự do sẽ đƣợc bài tiết ra ngoài theo phân. Hơn nữa, các muối mật bị khử liên kết cũng ít có hiệu quả trong việc hòa tan và hấp thu các lipid trong ruột. Do đó, sự khử liên kết muối mật có thể dẫn đến sự giảm cholesterol trong