a. Khảo sát đặc tính sinh học
Mục đích
- K .
- Khả ằ ợ
ậ ạ .
- Khảo sát khả năng lên men acid lactic.
Tiến hành thí nghiệm - ẩn L. casei trƣờ 37oC trong 48 giờ. - m Gram [3]. sinh . casei - 10 37oC trong 24 giờ. - 100 37o 3 giờ 600 nm. - 600) v (CFU/ml) [7]. - 600 . - L. casei.
Khảo sát khả năng lên men acid lactic
- 10 ml môi
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
41
-
100 1 370C. Mẫu đối chứng là môi
trƣờng MRS lỏng không cấy vi khuẩn L. casei.
- Tại thời điểm 0, 24, 48, và 72 giờ; lấy 10 ml dung dịch lên men vi khuẩn, xác định lƣợng acid lactic hiện diện bên trong dịch lên men.
- Thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần lập lại.
b. Khảo sát đặc tính probiotic
Mục đích
Kiểm tra khả năng chống chịu của L. casei trong các điều kiện cực đoan của dịch dạ dày, muối mật; tiềm năng kháng lại các loài vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột và khử cholesterol.
Khảo sát khả năng chịu pH thấp của dịch dạ dày nhân tạo (SGJ) Bố trí thí nghiệm: theo bảng 2.1
Nghiệm thức (pH) Thời gian (phút)
2.0 0 30 60 90 120
2.5 0 30 60 90 120
3.0 0 30 60 90 120
5.8 (ĐC) 0 30 60 90 120
Tiến hành thí nghiệm: dựa trên phƣơng pháp của Charteris và c.s., (1998) [23]. - Ly tâm dịch nuôi L. casei sau 24 giờ nuôi cấy với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút
Bảng 2.1. Khảo sát khả năng chịu pH thấp của L. casei trong môi trƣờng SGJ theo thời gian
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
42
- Thu sinh khối, rữa 2 lần với nƣớc muối sinh lý.
- Bổ sung 100 µl dịch huyền phù tế bào vào 10 ml dung dịch SGJ đƣợc điều chỉnh pH nhƣ bảng 2.1, ủ ở 370C. Mẫu đối chứng là môi trƣờng MRS pH 5.8. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thực hiện 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn L. casei (log (CFU/ml)) tại các thời điểm nhƣ bảng 2.1.
Khảo sát khả năng chịu muối mật
Bố trí thí nghiệm: nhƣ bảng 2.2
Nghiệm thức Thời gian (giờ)
MM 0 1 2 3 4
ĐC 0 1 2 3 4
Tiến hành: dựa trên phƣơng pháp của Dunne và c.s., (2001) [29].
- Ly tâm dịch nuôi L. casei sau 24 giờ nuôi cấy. Thu sinh khối, rữa 2 lần với nƣớc muối sinh lý.
- Bổ sung 100 µl huyền phù tế bào vào 10 ml dung dịch MRS đã bổ sung muối mật đạt nồng độ 0.3% (MM) và mẫu đối chứng (dung dịch MRS không bổ sung muối mật: ĐC), ủ ở 370C.
- Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn L. casei (log (CFU/ml)) tại các thời điểm nhƣ bảng 2.2.
Khảo sát khả năng sinh bacteriocin và các hợp chất tương tự bacteriocin Tiến hành thí nghiệm: dựa trên phƣơng pháp của Mishra và c.s., (2005) [66].
Bảng 2.2. Khảo sát khả năng chịu muối mật của
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
43
Chuẩn bị dung dịch chứa bacteriocin và các hợp chất tương tự bacteriocin
- Cấy vi khuẩn L. casei vào ống nghiệm chứa môi trƣờng MRS lỏng, ủ ở 370C trong 24 giờ. Ly tâm dịch nuôi vi khuẩn, thu nhận dịch nổi.
- Điều chỉnh pH của dung dịch thu nhận về pH 6,5 và lọc bằng màng lọc vô trùng.
Chuẩn bị đĩa môi trường chứa vi khuẩn chỉ thị.
- Môi trƣờng LB – Agar đĩa đƣợc phủ lên 1 lƣợng vi khuẩn chỉ thị sao cho nồng độ vi khuẩn chỉ đạt 108
CFU/ml. Các chủng vi khuẩn chỉ thị gồm: Bacillus subtilis
UCC 118 (Gram +), Salmonella typhimuriumATCC 25169 (Gram -).
- Đục các lỗ giếng có đƣờng kính 5 mm trên môi trƣờng.
- Bổ sung 100 µl dung dịch nuôi cấy chủng L. casei đã chuẩn bị ở trên vào giếng thạch.
- Ủ các đĩa ở 370C trong 24 giờ. - Thực hiện 3 lần lập lại.
Chỉ tiêu theo dõi: đƣờng kính vòng tròn vô khuẩn (mm) xuất hiện xung quanh giếng thạch.
Khử cholesterol
Tiến hành thí nghiệm: dựa trên phƣơng pháp của Noh và c.s., (1997)[71].
- Môi trƣờng MRS lỏng đƣợc bổ sung muối mật và cholesterol sao cho đạt đƣợc nồng độ 0.3% muối mật và 100 µg/ml cholesterol. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ly tâm dịch nuôi cấy vi khuẩn L. casei sau 24 giờ nuôi cấy. Thu sinh khối, rữa 2 lần với nƣớc muối sinh lý.
- Bổ sung 100 µl huyền phù tế bào vào 10 ml môi trƣờng có chứa cholesterol nhƣ đã chuẩn bị ở trên. Ủ ở 370C trong 20 giờ. Mẫu đối chứng là môi trƣờng cholesterol không bổ sung tế bào L. casei.
- Thực hiện 3 lần lập lại.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lƣợng cholesterol (µg/ml) trong môi trƣờng sau 20 giờ nuôi cấy vi khuẩn.
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
44
c. Khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao của vi khuẩn L. casei
Bố trí thí nghiệm: nhƣ bảng 2.3
Thời gian (phút) Nhiệt độ (0C)
0 37 (ĐC) 45 50 55 60 65 70
15 37 (ĐC) 45 50 55 60 65 70
Tiến hành thí nghiệm: dựa trên phƣơng pháp của Ding và c.s., (2007) [28]. - Ly tâm dịch nuôi L. casei sau 24 giờ nuôi cấy. Thu sinh khối, rữa 2 lần với nƣớc muối sinh lý.
- Bổ sung 100 µl huyền phù tế bào vào ống nghiệm chứa 10 ml dung dịch Peptone pH 6.5.
- Các ống nghiệm này đƣợc ủ 15 phút ở các nhiệt độ theo bảng 2.3. - Mẫu đƣợc làm mát ở 220C.
- Thực hiện thí nghiệm 3 lần lập lại.
Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn L. casei (log (CFU/ml)) sau khi xử lý nhiệt.