1.5.1. Bột sữa chua
Sữa chua là sản phẩm lên men từ sữa với vi khuẩn S. thermophilus và L. bulgaricus rất giàu protein. Sản phẩm này đƣợc ngƣời tiêu dùng ƣa chuộng bởi hƣơng vị thơm ngon (chủ yếu là do acetaldehyde) và cấu trúc của nó.
Tuy nhiên, thời hạn sử dụng của sữa chua là khá ngắn, 1 ngày trong điều kiện nhiệt độ phòng (25-300C) và khoảng 5 ngày ở 70C (Salji và c.s., 1987) và đây là yếu tố quan trọng cản trở việc thƣơng mại hóa của sản phẩm. Sữa chua luôn đƣợc duy trì ở mức 2 – 40C trong suốt chuỗi phân phối, không chỉ tránh đƣợc nguy cơ hƣ hỏng từ nấm men và nấm mốc mà còn ngăn chặn hoạt động hơn nữa bởi các giống khởi động. Tuy nhiên, điều này làm tăng giá thành của sản phẩm [55].
Để nâng cao thời gian bảo quản của sữa chua, có thể thực hiện bằng cách hạ thấp hàm lƣợng nƣớc có trong sản phẩm với việc loại nƣớc của Whey. Hoặc một cách khác nữa là sấy khô ví dụ nhƣ sấy đông khô, sấy phun hoặc sấy bằng vi sóng. Với mục
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
29
đích chính là nhằm bảo vệ sản phẩm dạng bột trong một thời gian dài sử dụng với tính chất ổn định mà không cần để ở điều kiện lạnh. Sữa chua sấy khô sẽ rất tiện lợi cho việc đóng gói và lƣu trữ, đồng nghĩa với việc giảm chi phí do giảm khối lƣợng và không cần trữ lạnh trong khâu vận chuyển. Nhƣng vẫn giữ đƣợc các thuộc tính ban đầu vốn có của sữa chua [55].
Bằng chứng của sản phẩm bột sữa chua có thể đƣợc tìm thấy ở vùng Tây Á; ở Turkestan, sản phẩm đƣợc gọi là churpi hoặc zurpi [91]. Bột sữa chua, đƣợc sản xuất bằng cách làm khô sữa chua tƣơi, có thể đƣợc sử dụng nhƣ thành phần để sản xuất các sản phẩm thực phẩm nhƣ bánh kẹo, sữa chua uống trộn với trái cây hoặc rau quả, hỗn hợp thức uống nhanh, thành phần chính của súp, nƣớc chấm và nƣớc sốt cũng nhƣ trực tiếp tiêu thụ sau khi hoàn nguyên [55]. Nó chứa các vi khuẩn lên men sữa chua (L. bulgaricus và S. thermophilus), một vài dòng sản phẩm bổ sung thêm probiotic có hàm lƣợng protein cao nhƣ trong sữa chua tƣơi.
Trƣớc đây, sữa chua hoàn nguyên có mật độ giống khởi động thấp do bị chết trong giai đoạn sấy ở nhiệt độ cao, hƣơng vị và cấu trúc không bằng sữa chua truyền thống. Tuy nhiên, đã có những nỗ lực đáng kể trong những năm gần đây để cải thiện chất lƣợng của sữa chua sấy khô bằng cách thêm vào những chất phụ gia nhƣ sucrose,
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
30
dextrose; hay những chất ổn định bao gồm xanthan gums, tinh bột, Natri alginate, …[91].
Nhìn chung bột sữa chua đƣợc chia thành hai loại: loại đầu tiên là sữa chua hoàn nguyên đƣợc ủ trong một vài giờ để cho phép quá trình đông tụ diễn ra và loại thứ hai với cấu trúc gel đƣợc hình thành trong một thời gian rất ngắn (gọi là instant yoghurt) [91].
1.5.2. Sấy phun
Mục tiêu chính của sấy sữa chua là để bảo vệ chúng ở dạng bột ổn định với chất lƣợng cao trong thời gian sử dụng mà không cần phải trữ ở điều kiện lạnh. Bột này có thể đƣợc tạo ra bằng cách phƣơng pháp khác nhau nhƣ sấy thăng hoa, sấy phun, sấy bằng vi sóng và sấy chân không.
Sấy thăng hoa cho đến nay đƣợc đánh giá là phƣơng pháp tốt nhất nhằm sấy khô sản phẩm có chứa vi khuẩn với khả năng duy trì tỉ lệ sống cao [55]. Tuy nhiên, chi phí sấy thăng hoa đã cản trở quá trình đƣa phƣơng pháp này vào trong quy mô sản xuất lớn.
Hiện tại, sấy phun đƣợc nghiên cứu và sử dụng rộng rãi thay thế cho sấy thăng hoa vì nó có tốc độ loại bỏ độ ẩm cao, giảm chi phí và thời gian do quá trình sấy diễn ra trong thời gian ngắn [24].
Sấy phun là phƣơng pháp biến các sản phẩm dạng lỏng hoặc sệt thành dạng bột rất nhanh chóng với luồng khí nóng. Là quá trình duy nhất trong đó các hạt hình thành đồng thời ngay khi chúng đƣợc sấy khô [74]. Đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc sấy khô nhiều loại vật liệu nhạy cảm với nhiệt nhƣ thực phẩm và dƣợc phẩm. Với ƣu điểm là tạo ra sản phẩm với kích thƣớc khá đồng nhất [68].
Hiện tại, phƣơng pháp này rất thích hợp cho sử dụng ở quy mô công nghiệp [24]. Máy hoạt động bởi dòng nhập liệu (chất lỏng hoặc chất bán rắn) đƣợc dẫn vào và đƣợc phân tán thành những hạt sƣơng nhỏ li ti thông qua vòi phun. Dòng nguyên liệu đi vào sẽ đƣợc sấy bởi dòng không khí nóng và sau đó phân tử nƣớc sẽ bốc hơi. Chất
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
31
rắn đƣợc hình thành bởi quá trình thoát hơi nƣớc một cách nhanh chóng. Vòi phun ngoài mục đích để tạo những giọt nhỏ li ti, nó còn có chức năng tối đa hóa quá trình truyền nhiệt và tỷ lệ bốc hơi nƣớc [70].
Trong mỗi máy sấy phun luôn có bộ phận bơm nguyên liệu, phân tán nguyên liệu, thổi không khí nóng, phân tán không khí, buồng sấy, thiết bị cho thu hồi sản phẩm, chuyên chở, đóng gói và loại bỏ không khí (Devakate và c.s, 2009). Phần phân tán nguyên liệu (phun sƣơng) là quan trọng nhất trong máy sấy phun. Trong bất kỳ loại phun sƣơng, năng lƣợng là yếu tố cần thiết để phá vỡ số lƣợng lớn chất lỏng để tạo ra các giọt nhỏ. Tùy thuộc vào loại năng lƣợng đƣợc sử dụng để sản xuất các hạt sƣơng, phun sƣơng có thể đƣợc phân loại thành bốn loại chính: ly tâm, áp suất, động lực và âm thanh (Barbosa-Canovas và c.s., 2005) [74].
1.5.2.1. Ƣu và nhƣợc điểm của sấy phun a. Ƣu điểm a. Ƣu điểm
Thời gian tiếp xúc giữa các hạt lỏng và tác nhân sấy trong thiết bị rất ngắn, do đó nhiệt độ của mẫu nguyên liệu đem sấy không tăng quá cao. Nhờ đó, sự tổn thất các hợp chất dinh dƣỡng mẫn cảm với nhiệt độ có trong mẫu là không đáng kể. Ngoài ra, sản phẩm sấy phun thu đƣợc là những hạt nhỏ có hình dạng và kích thƣớc tƣơng đối đồng nhất, tỷ lệ khối lƣợng giữa các cấu tử không bay hơi trong sản phẩm tƣơng tự trong mẫu lỏng ban đầu [5].
Một ƣu điểm khác nữa là thiết bị sấy phun trong thực tế sản xuất thƣờng có năng suất cao và làm việc theo nguyên tắc liên tục. Điều này góp phần làm hiện đại hóa các quy trình sản xuất công nghiệp [5].
b. Nhƣợc điểm
Mặc dù có những ƣu điểm đáng kể, phƣơng pháp này vẫn tồn tại những nhƣợc điểm: sản phẩm thu đƣợc bị giới hạn, không thể sử dụng mẫu nguyên liệu có độ nhớt quá cao hoặc sản phẩm thu đƣợc có tỷ trọng cao. Bên cạnh đó, mỗi thiết bị sấy phun thƣờng đƣợc thiết kế để sản xuất một số sản phẩm với những tính chất và chỉ tiêu đặc
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
32
thù riêng. Ngoài ra, vốn đầu tƣ thiết bị sấy phun khá lớn khi so sánh với các thiết bị sấy liên tục khác [5].
1.5.2.2. Các yếu tố gây chết tế bào vi sinh vật bởi sấy phun
Có nhiều nghiên cứu khẳng định khi tăng nhiệt độ đầu vào sẽ ảnh hƣởng đến sức sống của vi sinh vật (Mauriello và c.s., 1999) [74]. Tuy nhiên theo Kim và c.s., (1990) không có sự tƣơng quan rõ ràng về khả năng bất hoạt vi sinh vật bởi nhiệt độ không khí đầu vào và đây chỉ là yếu tố tác động nhỏ. Bởi vì mức độ bất hoạt vi khuẩn trong quá trình sấy phun phụ thuộc vào sự kết hợp giữa thời gian và nhiệt độ sấy [51]. Các nhà khoa học khác lại báo cáo rằng nhiệt độ không khí đầu ra tăng làm giảm sức sống của vi sinh vật sau khi sấy phun (Kim và c.s., 1990; Lian và c.s., 2002). Thông số này bị ảnh hƣởng bởi nhiệt độ không khí đầu vào, tốc độ lƣu lƣợng không khí, tốc độ tạo sản phẩm, thành phần của nguyên liệu và kích thƣớc hạt phun (Boza và c.s., 2004; Santivarangkna và c.s, 2008). Tuy nhiên, rất khó để tính toán cho vấn đề tối ƣu hóa các biến này và điều này có thể dẫn đến sự thay đổi lớn trong khả năng tồn tại của vi sinh vật đã sấy khô (Roelans và c.s., 1990) [74].
Janning và c.s., (1994) cho rằng hai yếu tố chính ảnh hƣởng đến khả năng tồn tại của vi sinh vật trong quá trình sấy là do nhiệt độ và sự mất nƣớc. Nhƣng để biết chính xác yếu tố nào gây hại nhiều hơn thì chƣa chứng minh đƣợc vì 2 yếu tố này diễn ra đồng thời. Trong sấy phun, giống khởi động acid lactic đƣợc sấy trong dòng không khí nóng, bởi thế sự bất hoạt của tế bào diễn ra ở nhiệt độ cao có thể diễn ra đồng thời với bất hoạt do mất nƣớc [74].
a. Bất hoạt do nhiệt
Kể từ khi nhiệt độ cao đƣợc nghiên cứu chủ yếu nhƣ là một nguyên nhân để gây chết hoặc làm giảm số lƣợng vi sinh vật trong thực phẩm sấy khô, đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến việc xác định thành phần nào quan trọng bên trong tế bào bị tổn thƣơng để gây nên bất hoạt tế bào [86].
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
33
hại của các đại phân tử DNA, RNA và protein hoặc các siêu phân tử nhƣ màng và các ribosome từ tác động của nhiệt. Nhƣng để xác định chính xác thành phần quan trọng nào hoặc trình tự các sự việc diễn ra trong quá trình phá hủy thì rất khó bởi vì nhiệt độ đồng thời ảnh hƣởng không chỉ riêng các phân tử mà còn ảnh hƣởng đến cấu trúc của tế bào. Khi tế bào chết kéo theo sự biến tính của thành phần tế bào và thành phần tế bào then chốt sẽ biến tính trƣớc tiên. Theo Santivarangkna và c.s., (2008), dƣới nhiệt độ 640C (nhiệt độ gây nguy hiểm cho tế bào) cấu trúc màng và bên trong tế bào vẫn còn giữ nguyên vẹn. Tuy nhiên từ 650C trở lên, ribosome và protein bị biến tính đồng thời với giai đoạn chết của tế bào [86].
b. Bất hoạt do loại nƣớc
Bất hoạt do yếu tố loại nƣớc đối với các giống khởi động acid lactic có thể xảy ra trong suốt thời gian sấy tại nhiệt độ sinh lý hoặc ở nhiệt độ cực thấp (đông khô) hoặc rất cao (sấy phun).
Tế bào vi khuẩn chứa từ 70-95% là nƣớc và các phân tử nƣớc đóng góp vào sự ổn định của protein, DNA và lipid cũng nhƣ thay đổi trật tự cấu trúc đáp ứng lên tế bào. Do đó việc loại nƣớc có ảnh hƣởng rất lớn đến sinh lý của tế bào (Potts, 1994). Khi các tế bào bị sấy khô có hàm lƣợng nƣớc thấp, các thành phần cấu trúc nên tế bào cũng bị biến đổi [85]. Màng tế bào chất đƣợc coi là thành phần nhạy cảm nhất trong quá trình mất nƣớc, bởi vì nó mất đi một số thành phần nội màng khi màng tế bào bị hƣ hỏng [81].
Ngƣời ta ƣớc tính rằng có khoảng 80% các phản ứng sinh lý của sinh vật phụ thuộc chủ yếu vào sự chuyển động của các liên kết nƣớc (Webb, 1960). Việc loại bỏ các phân tử nƣớc tự do dƣờng nhƣ có ít nhiều tác dụng bất lợi đến khả năng tồn tại của các tế bào (Santivarangkna và c.s., 2007b) . Bên cạnh đó, trong suốt quá trình sấy khô, các tế bào có khuynh hƣớng tiếp xúc với một thể tích không khí và do đó quá trình oxy hoá lipid có thể xảy ra (Teixeira và c.s., 1996). Kết quả của quá trình oxy hóa lipid có thể dẫn đến việc thay đổi tính chất vật lý trong cấu trúc và động lực học của màng (In
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
34
‗t Veld và c.s., 1992; Borst và c.s., 2000). Trong khi chỉ ghi nhận có sự thay đổi nhỏ các acid béo xuất hiện trong quá trình sấy đông khô hay sấy chân không (Brennan và c.s, 1986) [86].
Mặc dù có những ƣu điểm nổi bật, nhƣng nhiệt độ cao trong quá trình sấy phun ảnh hƣởng rất nhiều đối với sức sống của vi sinh vật và đây chính là điều khó khăn cho quá trình sản xuất các sản phẩm bột có hoạt tính probiotic nhƣ sữa chua probiotic.
D , sử dụ là việc cần thiết trong trƣờng hợp này nhằm bảo
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
35
2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN
Địa điểm: phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa kỹ thuật Hóa học, Trƣờng Đại Học Bách Khoa Tp.HCM.
Thời gian: tháng 7 năm 2011 đến tháng 5 năm 2012
2.2. VẬT LIỆU
2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu bao gồm: Lactobacillus casei VTCC 186, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus có nguồn gốc từ Trung tâm lƣu trữ giống vi sinh vật chuẩn – Đại học Quốc Gia Hà Nội.
2.2.2. Vật liệu và hóa chất 2.2.2.1. Dụng cụ và thiết bị 2.2.2.1. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ
Các dụng cụ thí nghiệm phổ biến trong các phòng thí nghiệm vi sinh nhƣ: ống nghiệm, đĩa Petri, đèn cồn, que cấy, que trải, cốc thủy tinh, bình tam giác và ống đong, v.v. Thiết bị - /CO2 incubator/Mco-18Aic - – Yamoto - 85 - (Genesys 20) - 2202 S - 22R - - - . - 510 - AND, Mx-50
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
36
2.2.2.2. Hóa chất
Dung dịch Natri alginate (2.0, 2.5, 3.0 và 3.5 %)
Natri alginate 20-35g
Nƣớc cất đủ 1000ml
Nƣớc muối sinh lý (0,85% NaCl)
NaCl 8,5g Nƣớc cất đủ 1000ml Đệm Phosphate saline (pH = 7, 0.1M) Na2HPO4, 0,0622 g NaH2PO4 0,0639 g Nƣớc cất đủ 1000 ml Dung dịch CaCl2 0.1M CaCl2 11,1 g Nƣớc cất đủ 1000 ml
Hóa chất dùng trong các khảo sát về đặc điểm probiotic
Muối mật (Simulated Intestinal Fluid: SIF)
Chuẩn bị nhƣ Gildas và c.s., (2009) [33].
NaCl 9 g/l
Mật bò 3g/l
pH= 6.5
Dịch dạ dày nhân tạo (Simulated Gastric Juice: SGJ)
Chuẩn bị nhƣ Gildas và c.s., (2009) [33].
NaCl 9 g/l
Pepsin 3 g/l
pH= 2 – 3
Các hóa chất khác
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học 37 –Cồn 90o –Phenolphtalein 1% –Bộ kit xác định hàm lƣợng cholesterol, v.v. 2.2.2.3. Môi trƣờng
Môi trƣờng MRS: dùng để nuôi cấy các chủng Lactobacillus
Peptone 10g Cao thịt 10g Cao nấm men 5g Glucose 20g CH3COONa 5g K2HPO4 2g CH3COO(NH4) 2g MgSO4 0,2g MnSO4 0,2g Tween 80 1ml Nƣớc cất 1000ml pH = 5,8
Môi trƣờng MRS – Agar: Môi trƣờng MRS bổ sung 2% agar.
Môi trƣờng MRS Sorbitol: môi trƣờng chọn lọc L. casei (chuẩn bị nhƣ Tharmaraj và c.s, 2003) [95]. Peptone 10g Cao thịt 10g Cao nấm men 5g CH3COONa 2g K2HPO4 2g CH3COO(NH4) 5g MgSO4 0,1g
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học 38 MnSO4 0,05g Sorbitol 10g Nƣớc cất 1000ml pH = 5,8
Môi trƣờng cholesterol: Chuẩn bị nhƣ Noh và c.s., (1997) [71].
Cholesterol 100g
Muối mật 30g
MRS 1000ml
Môi trƣờng LB: dùng để nuôi cấy các chủng: E. coli, Salmonella typhimurium ... Tryptone 10g Cao nấm men 5g NaCl 5g Nƣớc cất đủ 1000ml pH = 7,5
Môi trƣờng LB – Agar: Môi trƣờng LB bổ sung 2% agar
Các vi sinh vật chuẩn
Salmonella typhimurium ATCC 25169 Bacillus subtils UCC 118
2.3. PHƢƠNG PHÁP
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
39
SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM TỔNG QUÁT
Vi khuẩn L. casei
Khảo sát đặc tính sinh học
Vi gói với Natri alginate
Lên men sữa chua
Bột sữa chua Sấy phun
Hoàn nguyên bột sữa chua.
Theo dõi thời gian bảo quản bột sữa chua
Tái khảo sát đặc tính probiotic của
L. casei trong bột sữa chua thành phẩm.
Khảo sát tỉ lệ phối trộn chất trợ sấy Maltodextrin. Khảo sát các thông số tối ƣu cho quá trình sấy phun (nhiệt độ, lƣu lƣợng dịch phun).
Khảo sát hiệu quả vi gói thông qua số lƣợng và chất lƣợng probiotic ở điều kiện cực đoan của quá trình sấy phun.
Khảo sát đặc tính probiotic.
Khảo sát khả năng chịu nhiệt
Khảo sát cấu trúc, chất lƣợng hạt vi gói
Khảo sát hiệu quả vi gói thông qua số lƣợng và chất lƣợng probiotic trong các điều kiện cực đoan.
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
40
2.3.1.1. Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn L. casei
a. Khảo sát đặc tính sinh học
Mục đích
- K .
- Khả ằ ợ