1.4.1. Định nghĩa bao vi gói
Theo King (1995), bao vi gói đƣợc hiểu là quá trình tạo thành một lớp màng mỏng, nhƣ một lớp vỏ bọc gói gọn hoàn toàn khối vật chất trong lòng nó (phần lõi). Phần lõi này có thể ở dạng rắn, giọt lỏng hoặc bọt khí, lấp đầy vùng không gian bên trong lớp vỏ. Cả hai hợp phần này tạo thành những hạt có kích thƣớc khác nhau. Dựa vào kích thƣớc hạt, kỹ thuật bao gói đƣợc chia làm 3 loại sau [67]:
Bao gói lớn: kích thƣớc hạt lớn hơn 5.000µm. Bao vi gói: kích thƣớc hạt từ 0.2-5.000 µm. Bao siêu vi gói: kích thƣớc hạt nhỏ hơn 0,2 µm.
1.4.2. Bao vi gói tế bào vi sinh vật
Đƣợc định nghĩa là quá trình bẫy hoặc nhốt tế bào vi sinh vật bởi một lớp gel nƣớc, có vai trò nhƣ lớp vỏ bọc để phân cách, bảo vệ tế bào với các ảnh hƣởng của môi trƣờng xung quanh và giải phóng chúng đúng thời điểm mong muốn của mỗi ứng dụng cụ thể [53], [90].
Tác nhân giúp giải phóng hệ vi sinh vật đƣợc vi gói thƣờng là: do thay đổi pH, áp suất cơ học, tác dụng nhiệt xử lý (nhiệt độ nóng hoặc nhiệt lạnh), hoạt động enzyme, áp suất thẩm thấu, một số hợp chất hóa học và thời gian lƣu trữ, … [67].
1.4.3. Cấu trúc hạt vi gói
Mỗi hạt vi gói bao gồm lớp gel ƣa nƣớc bao bọc tế bào vi sinh vật, còn gọi là vỏ bọc. Vì vỏ có cấu trúc gel nên còn gọi là hạt gel. Hình dạng hạt thƣờng là hình cầu hoặc elip nên cũng đƣợc gọi là hạt vi cầu. Hạt có bề mặt phẳng hoặc gồ ghề (hình 1.4/1.1). Mỗi hạt chứa một hoặc nhiều tế bào vi sinh vật.
Khi vi gói tế bào, chất lỏng qua khe hở lấp đầy không gian bên trong hạt. Vết nứt trên bề mặt hoặc sâu bên trong có thể xuất hiện ở hạt (hình 1.4/1.1). Sự gia tăng vết nứt dẫn đến hình thành lỗ và nhƣ vậy làm giảm hiệu quả vi gói.
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
20
hiệu quả vi gói. Lớp thứ 2 đƣợc gọi là vỏ ngoài hoặc lớp bọc bổ sung (hình 1.4/1.3) [67].
1.4.4. Nguyên vật liệu cho vi gói
Có rất nhiều vật liệu tạo gel nhƣng để sử dụng vi gói tế bào vi sinh vật cần đạt một số yêu cầu chính nhƣ sau [67]:
Dễ dàng tạo lớp gel bao quanh tế bào vi sinh vật.
Không độc với cơ thể vật chủ, vi sinh vật (an toàn hoặc tƣơng thích sinh học). Giá thành thấp.
Điều kiện tiến hành, việc chuẩn bị và thao tác đảm bảo đơn giản. Giải phóng tế bào vi gói dễ dàng.
Không mẫn cảm với sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men.
Không hoặc ít tƣơng tác với môi trƣờng ngoài đến khi giải phóng phần lõi. Hạn chế những vết nứt, rạn và kích cỡ lỗ phải phù hợp với mục đích vi gói. Một số loại vật liệu thƣờng dùng nhƣ: alginate và phức hợp, tinh bột, hỗn hợp xanthan-gelan, carrageenan và hỗn hợp, gelatin, cellulose acetate phethalate, … Trong
1.1 1.2 1.3
Hình 1.4. Cấu trúc hạt vi gói [67]
1.1. Hạt tế bào đơn: tế bào vi khuẩn (a), bề mặt không phẳng (b), bề mặt phẳng (c), bề mặt gãy (d); 1.2. Hạt đa tế bào: tế bào vi khuẩn (a), chất lỏng bên trong hạt (b), vỏ bọc (c); 1.3. Hạt tế bào vi gói: tế bào vi khuẩn (a), vỏ bọc (b), vỏ bọc ngoài (c).
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
21
đó, alginate là cơ chất thông dụng nhất.
1.4.4.1 Cấu tạo của alginate
Alginate là polysaccharide dị hợp mạch thẳng đƣợc chiết tách từ các loại tảo khác nhau, với 2 đơn vị cấu trúc là β-D-mannuronic và α-L-guluronic acid. Alginate hình thành từ sự liên kết giữa các monomer này ở các vị trí C-1 và C-4 bằng liên kết glucozide, tỉ lệ của 2 hợp phần này (mannuronic:guluronic acid) thƣờng là 1:5. Dạng thƣơng phẩm của alginate thƣờng là Natri alginate. Trọng lƣợng phân tử của alginate dao động từ 32-200 kdal, hấp thụ nƣớc ở dạng muối của kim loại kiềm, magnesium, ammonia hoặc muối amin. Alginate là tác nhân làm dày, ổn định và tạo gel rất thông dụng trong công nghiệp thực phẩm [15].
1.4.4.2. Tính chất của alginate
Đặc tính quan trọng của alginate là độ nhớt và khả năng tạo gel.
a.Độ nhớt dung dịch alginate: phụ thuộc bởi nhiều yếu tố. Theo Belitz, và c.s., (1999) [15]:
Trọng lƣợng phân tử alginate: khi trọng lƣợng phân tử càng cao, độ nhớt càng cao.
Tỉ lệ ion của muối: độ nhớt tỉ lệ thuận với nồng độ cation đa hóa trị. Vì thế, khi
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
22
dung dịch alginate có tác nhân chelate (tác nhân xúc tác tạo thành hợp chất hữu cơ có nhiều hơn một liên kết với các ion kim loại trong dung dịch), độ nhớt sẽ giảm.
Quá trình làm đông và rã đông dung dịch alginate: không ảnh hƣởng đến độ nhớt của dung dịch. Tuy nhiên, khi có mặt ion Ca2+, quá trình làm đông và rã đông sẽ làm tăng độ nhớt của dung dịch.
Nhiệt độ: khi nhiệt độ tăng 10C, độ nhớt tăng 25% nhƣng khi tăng nhiệt độ rồi lại hạ nhiệt độ thì độ nhớt của dung dịch alginate thấp hơn ban đầu.
Xuất xứ của nguồn tảo chiết xuất: tảo ôn đới thƣờng có độ nhớt khá cao.
Quá trình bảo quản: khi bảo quản ở nhiệt độ cao, alginate sẽ bị phân hủy và sau một thời gian thì độ nhớt của nó giảm xuống đáng kể.
Giá trị pH của dung dịch: pH thấp, alginate sẽ bị mất điện tích âm, làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi và tạo liên kết hydro làm tăng độ nhớt, hình thành gel. pH cao (pH>11) alginate bị cắt chuỗi polymer, dung dịch giảm độ nhớt do liên kết glucoside dễ bị thủy phân trong môi trƣờng kiềm.
b. Sự tạo gel của dung dịch alginate
Thông thƣờng, dung dịch alginate (thƣờng là Natri alginate) sẽ tạo gel hay tạo màng khi thêm vào dung dịch đa điện tích trái dấu (ion Ca2+) [15].
Tuy nhiên, cấu trúc gel sẽ bị yếu dƣới điều kiện acid thấp (pH 2-3). Ở điều kiện này, mạng lƣới liên kết chéo của ion Ca2+ bị thay thế khỏi mạng lƣới alginate và nhóm cacboxyl còn lại của alginate sẽ bị proton hóa thành dạng acid alginic tan trong nƣớc [72], [73]. Hơn nữa, khi có mặt ion Na+, cấu trúc gel sẽ bị vỡ bởi liên kết chéo của ion Ca2+ bị thay thế bởi ion Na+.[12], [72].
1.4.5. Các phƣơng pháp vi gói
Từ cuối thập kỉ 80, phƣơng pháp vi gói tế bào vi sinh vật đã đƣợc quan tâm nghiên cứu. Có 2 hƣớng chính là phƣơng pháp nén ép (extrusion) và phƣơng pháp tạo nhũ (emulsion).
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
23
1.4.5.1. Phƣơng pháp nhỏ giọt (nén ép)
Phƣơng pháp nhỏ giọt là phƣơng pháp xuất hiện sớm nhất và đƣợc sử dụng phổ biến nhất với chất gói là loại gel tan trong nƣớc (King, 1995). Nhìn chung, đây là phƣơng pháp đơn giản, ít tốn kém, nhẹ nhàng nên ít làm tổn thƣơng tế bào. Khả năng tƣơng hợp sinh học và tính linh hoạt là những tính chất đặc biệt của phƣơng pháp này [67].
Đầu tiên, huyền phù tế bào – alginate sẽ đƣợc đẩy xuyên qua kim tiêm để tạo các giọt nhỏ, rơi trực tiếp vào trong dung dịch chứa các cation canxi dƣới dạng CaCl2. Ngay lập tức polymer alginate bao chung quanh tế bào và hình thành khung 3 chiều bởi liên kết với ion Ca2+. Nồng độ phổ biến đƣợc sử dụng nằm trong khoản 1-2% cho alginate và 0.05–1.5M cho CaCl2. Hầu hết các giọt đƣợc tạo ra có đƣờng kính 2-3 mm [53].
1.4.5.2. Phƣơng pháp nhũ tƣơng hóa
Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng thành công để vi gói vi khuẩn lactic, so với phƣơng pháp nén ép, phƣơng pháp vi gói với hệ nhũ tƣơng có nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣng yêu cầu kỹ thuật cao hơn (Audet, 1998 và Lacroix, 1990) [67].
Trong kỹ thuật này, pha phân tán là huyền phù tế bào, alginate đƣợc thêm vào 1 lƣợng dầu thực vật nhƣ dầu đậu nành, dầu hƣớng dƣơng hay dầu bắp, đóng vai trò nhƣ pha liên tục (Groboillot, 1993). Dung dịch tạo thành sẽ đồng nhất hơn khi khuấy trộn với tốc độ thích hợp cho đến khi hệ nhũ tƣơng hình thành [67].
Khi đã có hệ nhũ tƣơng, thêm dung dịch CaCl2 vào ở dạng vi giọt để tạo mầm hạt gel trong pha dầu. Tốc độ khuấy trộn hỗn hợp cũng là nhân tố quyết định đƣờng kính hạt [53].
Đƣờng kính hạt và nồng độ alginate là các yếu tố quyết định khả năng sống của tế bào, sự trao đổi chất của chúng, giá trị cảm quan sản phẩm cuối cùng và khả năng phân tán các hạt trong sản phẩm (Picot, 2003a) [67].
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
24
Phƣơng pháp tiến hành vi gói: nhỏ giọt và nhũ tƣơng hóa đƣợc mô tả nhƣ hình 1.6.
1.4.5.3. Ƣu nhƣợc điểm của hai phƣơng pháp vi gói
Phƣơng pháp nén ép có ƣu điểm về chi phí thấp, kỹ thuật đơn giản nhƣng kích thƣớc vi gói phụ thuộc lớn vào đƣờng kính kim tiêm, quá trình tạo hạt và ổn định chất lƣợng hạt mất nhiều thời gian hơn kỹ thuật nhũ tƣơng hóa nên thích hợp với quy mô sản xuất nhỏ. Với kỹ thuật tạo nhũ tƣơng, trong công nghiệp thực phẩm sẽ dễ dàng cơ
Hình 1.6. Kỹ thuật vi gói [53]. Các hạt Ca-alginate
Dung dịch muối alginate Tế bào vi sinh vật
Trộn
Kỹ thuật nhỏ giọt Kỹ thuật tạo nhũ
Tạo nhũ trong dầu thực vật
Giọt huyền phù tế bào- Alginate
Cho vào dung dịch CaCl2 Cho giọt CaCl2 vào hệ nhũ để tạo gel
Dịch lỏng Tế bào vi sinh vật
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
25
giới hóa, mở rộng quy mô và tăng hiệu suất vì quá trình tạo hạt nhanh và ổn định chất lƣợng hạt, kích thƣớc hạt nhỏ khó nhận biết trong thực phẩm, tạo cảm giác về cảm quan tốt. Tuy nhiên, quá trình thực hiện phải qua công đoạn nhũ hỗn hợp huyền phù tế bào – chất tạo gel, chính chất tạo nhũ làm tăng chi phí sản xuất của kỹ thuật này [53].
[53]
1.4.6. Vai trò của vi gói
Vi gói có thể sử dụng hiệu quả cho việc tạo giống khởi động có khả năng sống cao dù trải qua quá trình lên men, bảo quản lạnh đông sâu hay điều kiện khắc nghiệt của quá trình chế biến (gia nhiệt, phối trộn, xử lý acid hoặc kiềm, …) (Picot, 2003a; Sultana, 2000) [67].
Bao vi gói có thể cải thiện đáng kể khả năng sống của tế bào vi sinh vật chống lại các nhân tố môi trƣờng bất lợi trong quá trình chế biến thực phẩm: nồng độ acid cao, pH thấp, ảnh hƣởng của oxy (trong trƣờng hợp vi khuẩn kị khí bắt buộc), nhiệt xử lý, quá trình bảo quản lạnh đông sâu, …; vì thế tăng thời gian bảo quản sản phẩm, đặc biệt với sản phẩm probiotic [67].
Các chỉ tiêu so sánh Nén ép Nhũ tƣơng hóa
Tính khả thi trong công nghiệp Chi phí
Sự đơn giản
Tỉ lệ sống sót của tế bào vi gói Kích thƣớc hạt của vi gói Khó khăn Thấp Cao 80 - 95% 2 – 5 mm Dễ dàng Cao Thấp 80 - 95% 25 µm – 2 mm
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
26
1.4.7. Nghiên cứu khả năng bảo vệ vi sinh vật của phƣơng pháp vi gói bằng alginate alginate
1.4.7.1. Nghiên cứu trong nƣớc
Đã có những nghiên cứu tiền đề cho thấy hiệu quả của kỹ thuật vi gói có khả năng bảo vệ vi khuẩn lactic trong các môi trƣờng không thuận lợi, điển hình qua báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Thúy Hƣơng và c.s., (2008). Nhóm tác giả báo cáo rằng, vi khuẩn lactic dễ bị hao hụt trong môi trƣờng sữa chua có độ acid cao, do đó đã tiến hành thực hiện vi gói 2 chủng vi khuẩn L. bulgaricus và S. thermophillus bằng phƣơng pháp nhốt trong nguyên liệu Natri alginat. Kết quả nghiên cứu cho thấy hạt vi gói có kích thƣớc 1,2 mm vừa có thể bảo vệ vi khuẩn, vừa không làm thay đổi chất lƣợng cảm quan sản phẩm sữa chua đậu nành [2].
Thông qua nguyên liệu hỗn hợp alginate – xanthan, nhóm nghiên cứu Liêu Mỹ Đông và c.s., (2011) đã tiến hành vi gói vi khuẩn Bifidobacteria Bifidum với mục đích nâng cao hoạt tính probiotic của vi khuẩn này. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi nồng độ Ca-Alginate đƣợc giữ cố định là 2.5%, hiệu quả bảo vệ vi sinh vật gia tăng khi gia tăng nồng độ Xanthan gum từ 0.1% đến 0.2% và đạt hiệu quả tốt nhất khi nồng độ Xanthan gum là 0.2% khi ủ chế phẩm vi gói này trong môi trƣờng dạ dày nhân tạo [1].
1.4.7.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc
Qua các nghiên cứu cho thấy rằng việc cố định các vi khuẩn probiotic bằng phƣơng pháp vi gói có thể cải thiện khả năng sống sót của những vi sinh vật này trong quá trình lƣu trữ sản phẩm và trong quá trình di chuyển qua hệ tiêu hóa [27]; [57]. Việc chọn lựa các loại vật liệu vi bao tùy thuộc vào các tính chất thuộc về chức năng của các chế phẩm sinh học và phƣơng pháp vi gói đƣợc sử dụng (Hegenbart, 1993) [25].
Nghiên cứu của Lee và c.s., (2000) cho rằng tỷ lệ sống sót của Bifidobacterium
longum KCTC 3128 và HLC 3742 trong dịch dạ dày và muối mật đƣợc cải thiện một
cách đáng kể khi cố định chúng trong các hạt Calcium alginate có chứa 2, 3 và 4% Natri alginate. Họ kết luận rằng, tỷ lệ chết của bifidobacteriagiảm tỉ lệ thuận với việc
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
27
tăng cả nồng độ gel alginate và kích thƣớc hạt [57].
Kết hợp alginate và chitosan đóng vai trò nhƣ phản ứng succinyl (tăng cƣờng chuyển đổi các anion để có thể giữ lại các proton) hay là acylation (tăng cƣờng chất nền kỵ nƣớc) đƣợc nhóm tác giả Canh Le-Tien và c.s., (2004) sử dụng cho việc nhốt các tế bào vi sinh vật. Kết quả nghiên cứu của họ cho thấy, các hạt (với đƣờng kính 3mm) đƣợc hình thành bởi quá trình đông tụ với dung dịch CaCl2 cho thấy đặc tính rất tốt về mặt cơ học. Kết quả thí nghiệm cho thấy với tế bào tự do, không còn tế bào nào của L. rhamnosus sống sót khi bổ sung chúng vào trong dịch dạ dày (pH=1.5). Tuy nhiên, đối với nghiệm thức vi khuẩn đƣợc vi bao trong các hạt alginate có tỷ lệ sống sót là 22-26% và tỷ lệ sống sót đƣợc cải thiện lên đến 60-66% trong các hạt đƣợc vi bao bằng hỗn hợp alginate và chitosan. Tỷ lệ sống sót đƣợc ghi nhận cao nhất đối với nghiệm thức vi khuẩn đƣợc vi bao bằng N- palmitoylaminoethyl alginate bởi vì vật liệu này có thể giới hạn sự mất nƣớc cho vi khuẩn trong môi trƣờng acid [20].
Krasaekoopt và c.s., (2004) cũng có kết luận tƣơng tự rằng hạt vi gói bằng alginate bao bọc bên ngoài là chitosan có khả năng bảo vệ hữu hiệu đối với L. acidophilus và L. casei trong dịch dạ dày nhân tạo pH=1.55 và dịch muối mật 0.6% [54].
Với nồng độ alginate 3%, Ding và c.s., (2007) tiến hành vi gói 8 loại vi khuẩn khác nhau: L. rhamnosus, Bifidobacterium longum, L. salivarius, L. plantarum, L. acidophilus, L. paracasei, B. lactis type Bl-O4 và B. lactis type Bi-07. Kết quả thí nghiệm của họ cho thấy alginate có khả năng bảo vệ tế bào vi sinh vật trong các điều kiện môi trƣờng cực đoan nhƣ acid của dạ dày (pH=2), muối mật (3%) và nhiệt độ cao (650C trong 30 phút). Báo cáo chỉ ra rằng, vi khuẩn probiotic đƣợc vi gói sống sót tốt hơn vi khuẩn tự do. Trong môi trƣờng có bổ sung muối mật 3%, tế bào vi khuẩn tự do giảm 6.51 log (CFU/mL), trong khi chỉ giảm 3.36 log (CFU/mL) ở vi khuẩn đƣợc vi gói trong thời gian là 8 giờ. Sau 30 phút xử lý nhiệt độ 650C, tế bào vi khuẩn không đƣợc vi gói giảm 6.74 log (CFU/mL) trong khi tế bào đƣợc vi gói chỉ giảm 4.17 log
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
28
(CFU/mL) [28].
Tiếp theo các nghiên cứu trên về hỗn hợp vi gói alginate và chitosan, nhóm tác giả Li và c.s., (2011) đã kết hợp phối trộn nguyên liệu vi gói alginate-chitosan- carboxymethyl chitosan dùng để vi bao vi khuẩn Lactobacillus casei ATCC 393. Tác dụng bảo vệ của vi bao thể hiện rõ rệt khi ủ các hạt vi gói trong dịch dạ dày pH=2 trong 2 giờ và muối mật 1% trong 6 giờ, L. casei vẫn còn sống sót với mật độ là 7.91 và 7.42 log (CFU/g) [58].
Từ những kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc cho thấy kỹ thuật bao vi gói