Mục đích
Chọn đƣợc nồng độ Natri alginate tối ƣu với phƣơng thức vi gói thích hợp.
Thí nghiệm 1: Tạo hạt vi gói
Bố trí thí nghiệm:
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
45
Nghiệm thức Nhỏ giọt Tạo nhũ
Nồng độ Na-alginate (%) Nồng độ Na-alginate (%) 1.1 2.0 2.0 1.2 2.5 2.5 1.3 3.0 3.0 1.4 3.5 3.5 Tiến hành thí nghiệm
Phương pháp nhỏ giọt: dựa trên phƣơng pháp của Krasaekoopt và c.s., (2004) [54]
- Nhân giống vi khuẩn L. casei cấp 2. Ly tâm dịch nuôi vi khuẩn, thu sinh khối tế bào, rữa 2 lần với nƣớc muối sinh lý.
- Bổ sung khoảng 109 (CFU/ml) vi khuẩn L. casei vào dung dịch Natri alginate với các nồng độ nhƣ bảng 2.4 theo tỉ lệ 1:4.
- Đồng hóa hổn hợp thu đƣợc ở trên thành pha đồng nhất. Dùng kim tiêm tạo giọt và cho rơi trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0,1M, để ổn định trong 1 giờ.
- Lọc, rữa các hạt vi gói với nƣớc muối sinh lý và trữ trong dung dịch Peptone 0,1% ở 40C.
Phương pháp tạo nhũ: dựa trên phƣơng pháp của Ding và c.s., (2007) [28]. - Nhân giống vi khuẩn L. casei cấp 2. Ly tâm dịch nuôi vi khuẩn, thu sinh khối, rữa 2 lần với nƣớc muối sinh lý.
- Bổ sung khoảng 109 (CFU/ml ) vi khuẩn L. casei vào dung dịch Natri alginate với các nồng độ nhƣ bảng 2.4 theo tỉ lệ 1:4.
- Bổ sung dầu thực vật vào hổn hợp trên theo tỉ lệ 5:1.
Bảng 2.4. Vi gói vi khuẩn L. casei với các nồng độ Natri alginate khác nhau
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
46
- Đồng hóa hỗn hợp trên, tạo hệ nhũ tƣơng.
- Bổ sung dung dịch CaCl2 0,1M ở dạng vi giọt đến khi hình thành mầm hạt gel trong pha dầu. Sau 30 phút, ly tâm để thu các hạt vi gói, rữa với nƣớc muối sinh lý và trữ trong dung dịch Peptone 0,1% ở 40C.
Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ alginate tối ƣu
Khảo sát cấu trúc hạt vi gói
Tiến hành: quan sát hạt vi gói với các nồng độ alginate nhƣ bảng 2.4 và chụp hình dƣới kính hiển vi điện tử quét.
Chỉ tiêu theo dõi: hình dạng, màu sắc, kích thƣớc và tính chất của hạt.
Khảo sát chất lượng vi gói
- Chất lƣợng hạt vi gói đƣợc đánh giá thông qua hiệu suất vi gói (% tế bào sống đƣợc vi gói) và đƣợc tính dựa vào công thức sau:
- Xác định tổng số tế bào sống trong hạt vi gói bằng cách dùng đệm phosphate (pH = 7, 0.1M) phá cấu trúc gel của hạt vi gói, phóng thích tế bào vi khuẩn đƣợc nhốt bên trong [22].
Khảo sát hiệu quả vi gói trong các điều kiện cực đoan Khảo sát trong môi trường SGJ pH 2
Bố trí thí nghiệm: nhƣ bảng 2.5
Tiến hành thí nghiệm:
- Bổ sung 1 g hạt vi gói vào 9ml dung dịch SGJ pH 2.
- Lọc lấy hạt vi gói ra khỏi dung dịch SGJ tại các thời điểm nhƣ bảng 2.5. và rữa hạt.
- Bổ sung 9 ml đệm phosphate vào hạt vi gói thu đƣợc để phá cấu trúc gel. - Sử dụng mẫu đối chứng là dạng vi khuẩn tự do.
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
47
- Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn L. casei (log (CFU/ml)) theo thời gian khảo sát. Nồng độ Na-alginate (%) Thời gian (phút) Nhỏ giọt Tạo nhũ 2.0 2.0 0 30 60 90 120 2.5 2.5 0 30 60 90 120 3.0 3.0 0 30 60 90 120 3.5 3.5 0 30 60 90 120
Khảo sát trong điều kiện nhiệt độ cao Bố trí thí nghiệm: nhƣ bảng 2.6. Nồng độ Na Alginate (%) Nhiệt độ (0C) Nhỏ giọt Tạo nhũ 2.0 2.0 55 60 65 70 2.5 2.5 55 60 65 70 3.0 3.0 55 60 65 70 3.5 3.5 55 60 65 70
Bảng 2.6. Khảo sát mật độ vi khuẩn L. casei vi gói ở nhiệt độ cao
Bảng 2.5. Khảo sát mật độ vi khuẩn L. casei vi gói trong môi trƣờng SGJ pH 2 theo thời gian
Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học
48
Tiến hành:
- Bổ sung 1 g hạt vi gói vào 9 ml dung dịch Peptone pH 6.5. Ủ ở các nhiệt độ nhƣ bảng 2.6 trong 15 phút.
- Mẫu đƣợc làm mát ở 220C.
- Lọc lấy hạt vi gói ra khỏi dung dịch Peptone pH 6.5 và rữa hạt.
- Bổ sung 9 ml đệm phosphate vào hạt vi gói thu đƣợc để phá cấu trúc gel. - Sử dụng mẫu đối chứng là dạng vi khuẩn tự do.
Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn L. casei (log (CFU/ml)) sau khi xử lý nhiệt.
Thí nghiệm 3: Khảo sát chất lƣợng probiotic với nồng độ Natri alginate tối ƣu
Khảo sát khả năng khử cholesterol Tiến hành thí nghiệm:
- Bổ sung 9 ml đệm phosphate vào 1 g hạt vi gói để phá cấu trúc gel.
- Tiến hành kiểm tra khả năng khử cholesterol của tế bào vi khuẩn dạng tự do sau 20 giờ nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lƣợng cholesterol trong môi trƣờng sau 20 giờ nuôi cấy (µg/ml).
Khảo sát khả năng sinh bacteriocin và các hợp chất tương tự bacteriocin Tiến hành:
- Bổ sung 9 ml đệm phosphate vào 1 g hạt vi gói để phá cấu trúc gel.
- Tiến hành kiểm tra khả năng kháng các chủng vi khuẩn chỉ thị gồm: Bacillus subtilis UCC 118 (Gram +), Salmonella typhimuriumATCC 25169 (Gram -) của tế bào vi khuẩn dạng tự do.
Chỉ tiêu theo dõi: đƣờng kính vòng tròn vô khuẩn xuất hiện xung quanh giếng thạch (mm).