NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3 Xác ñịnh tổng số vi khuẩn hiếu khí, số lượng E.coli và Salmonella
trong 1g phân
Số lượng vi khuẩn hiếu khí, số lượng vi khuẩn E.coli và Salmonella
ñược xác ñịnh theo kỹ thuật ñếm số khuẩn lạc theo phương pháp mơ tả bởi Quinn và cs (1994), trình bày tại phụ lục 4. Tóm tắt như sau: mẫu kiểm tra
được pha lỗng với dung dịch đệm pepton theo tỷ lệ 1/9 để đạt được các bậc pha lỗng thập phân khác nhau (10-1, 10-2…10-n). Mỗi mẫu kiểm tra phải ni cấy ít nhất 3 bậc pha lỗng liên tiếp, mỗi bậc pha lỗng ni cấy 2 ñĩa petri, trên các mơi trường đặc hiệu cho phép nhận dạng ban ñầu với vi khuẩn cần kiểm tra. Nuôi cấy hiếu khí ở nhiệt độ 370C để xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí, đọc kết quả sau 24 – 48 h. Nâng nhiệt độ ni cấy lên 420C ñể xác ñịnh số lượng E.coli và Salmonella.
ðể xác ñịnh số lượng vi khuẩn E.coli, mẫu kiểm tra được ni cấy trên mơi trường thạch MacC. Những khuẩn lạc có kích thước lớn (1mm – 3mm), trịn, mặt khơ, màu hồng cánh sen đều ñược xem xét là khuẩn lạc E.coli.
Chọn 5 khuẩn lạc điển hình để giám định các tính chất sinh hóa và xác định tỷ lệ rồi tính kết quả theo tỷ lệ xác ñịnh.
ðể xác ñịnh số lượng vi khuẩn Salmonella, mẫu phân sau khi pha lỗng được ria cấy trên môi trường BGA. Căn cứ vào ñặc ñiểm phát triển của khuẩn lạc trên mơi trường để xác định số lượng khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella.
Chọn 5 khuẩn lạc điển hình để kiểm tra đặc tính sinh hóa, và xác định tỷ lệ rồi tính tốn kết quả theo tỷ lệ ñã xác ñịnh.
Dãy phản ứng IMViC (Indole, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrat) là những tính chất sinh hóa bắt buộc kiểm tra, làm cơ sở ñể phân biệt các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột. Trong đó phản ứng Indole ñược coi là phản ứng nhạy cho phép phân biệt ban ñầu E.coli và Salmonella.
2.3.4 Xác ñịnh kháng nguyên pili của các chủng E.coli
Xác ñịnh kháng nguyên pili theo phương pháp ñồng ngưng kết (coagglutination test) mơ tả bởi Murray (1987), trình bày theo sơ đồ tại phụ lục 2, tóm tắt các bước theo trình tự trình bày dưới đây.
+ Chuẩn bị kháng nguyên: Các chủng E.coli sau khi phân lập và giám ñịnh một số ñặc ñiểm sinh học được cấy truyền trên mơi trường Trypticase
soy agar và bảo quản ở tủ lạnh âm (-700C). Các chủng trên được ni cấy trở lại trên môi trường Minca agar là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của kháng nguyên pili. Trên một số môi trường khác vi khuẩn mất khả năng sinh kháng ngun này. Ni cấy hiếu khí ở nhiệt ñộ 370C sau 24 h ñược sử dụng làm kháng nguyên.
+ Chuẩn bị kháng thể: Kháng thể ñồng ngưng kết (coagglutination antisera) ñược chuẩn bị theo hướng dẫn của nơi cung cấp.
+ Chuẩn bị kháng nguyên chuẩn: Theo hướng dẫn của nơi cung cấp. + Tiến hành: Dùng phiến kính trong, sạch, sau khi đã ngâm cồn ethanol 900, để khơ, sấy ở nhiệt độ 1200C trong 30 phút. Chia phiến kính làm 2 phần: Nhỏ lên mỗi phần ñã chia một giọt nước sinh lý 0,85%. Dùng que cấy trích lấy 1 - 2 khuẩn lạc E.coli trên mơi trường Minca agar, trộn đều với nước sinh lý rồi nhỏ kháng thể kháng pili F5 hoặc F41, F6, F5 + F41 lên giọt kháng nguyên ñã chuẩn bị, phía đối diện nhỏ một giọt nước sinh lý 0,85%. Thí nghiệm đối chứng được tiến hành với kháng nguyên chuẩn và kháng thể chuẩn.
Phản ứng ñược coi là dương tính khi những giọt kháng nguyên và kháng thể chuẩn hình thành những ñám ngưng kết màu trắng nhạt và phản ứng âm tính khi các huyễn dịch đục đều, khơng có ngưng kết.
2.3.5 Xác ñịnh khả năng sản sinh ñộc tố enterotoxin của vi khuẩn E.coli
và Salmonella
Bằng thử nghiệm sinh học theo phương pháp mô tả bởi Dean và cs (1972), Giannella (1976). Vi khuẩn E.coli và Salmonella cần kiểm tra ñộc tố ñường ruột được ni cấy hiếu khí trên mơi trường BHI ở nhiệt độ 370C sau 24 h. Ly tâm với tốc ñộ 3000 vòng/phút trong thời gian 30 phút. Bỏ cặn, sử dụng dung dịch ly tâm kiểm tra ñộc tố enterotoxin. Chia đơi dịch ly tâm, một phần xử lý nhiệt, phần cịn lại khơng xử lý. Bổ sung dung dịch Evans blue 2% vào mỗi ống nghiệm chứa 5ml dung dịch trên. Tiêm vào dạ dày chuột bạch sơ sinh
1 - 2 ngày tuổi, 0,1ml dung dịch cần kiểm tra ST. Mỗi chủng vi khuẩn kiểm tra tiêm cho 3 chuột. Sau khi tiêm, chuột ñược giữ ở nhiệt ñộ phòng, tách mẹ. Sau 4h, mổ chuột tách ruột, cân phần ruột và phần cơ thể còn lại trên cân phân tích có độ chính xác đến mg. Lấy trọng lượng trung bình mỗi loại (ruột và xác chuột cịn lại) của 3 chuột cho mỗi chủng vi khuẩn kiểm tra. Thí nghiệm đối chứng âm được tiến hành với chuột tiêm 0,1ml môi trường BHI. ðối chứng dương là cơ sở để đánh giá kết quả thí nghiệm, thực hiện theo thủ tục trên ñây với các chủng E.coli chuẩn, có khả năng sản sinh ST, nguồn gốc phân lập từ bê.
Tính tốn kết quả: R = Khối lượng ruột trung bình : Khối lượng xác chuột còn lại.