NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.9 Phương pháp xác ñịnh serotype của các chủng Salmonella
Xác ñịnh serotype của các chủng Salmonella phân lập ñược tiến hành trên cơ sở kháng nguyên O kết hợp pha 1, pha 2 kháng nguyên H bằng phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh theo hệ thống phân loại White- Kauffmann-Le Minor ñược mô tả bởi Patrick và Francois-Xavier Weill (2007). Các bước chính thực hiện thí nghiệm được mơ tả tóm tắt theo các trình tự dưới đây.
+ Loại bỏ những vi khuẩn tự ngưng kết: Bằng phương pháp kiểm tra trên phiến kính với nước muối sinh lý 0,85% NaCl. Nếu có hiện tượng ngưng
kết thì loại bỏ, nếu huyễn dịch ñục ñều sẽ tiến hành giám ñịnh theo các bước tiếp sau.
+ Kiểm tra kháng nguyên O ña giá của vi khuẩn Salmonella: Các bước
tiến hành giống như phương pháp kiểm tra loại bỏ các chủng vi khuẩn tự ngưng kết chỉ khác là dùng kháng huyết thanh O ña giá thay cho nước muối sinh lý. Các chủng kiểm tra dương tính với kháng huyết thanh O ña giá thì tiếp tục xác ñịnh kháng nguyên O ñơn giá và kháng nguyên H.
+ Xác ñịnh kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella bằng kháng huyết
thanh đơn giá nhóm O: Căn cứ vào kết quả xác định nhóm kháng ngun O đa
giá, tiến hành xác ñịnh kháng nguyên O ñơn giá bằng kháng huyết thanh đơn giá nhóm O, theo quy trình và đánh giá kết quả giống ở phần trên.
+ Xác ñịnh serotype kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella:
- Xác ñịnh kháng nguyên H, pha 1:
Cấy chủng vi khuẩn Salmonella cần giám ñịnh vào mơi trường BHI, ủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24giờ. Sau đó bổ sung một lượng tương đương dung dịch Saline (dung dịch nước muối sinh lý bổ sung 1% formol), để ở nhiệt độ phịng trong 2giờ. Sử dụng canh trùng trên ñể xác ñịnh kháng nguyên H pha 1, theo phương pháp tiến hành trong ống nghiệm: Chuyển vào mỗi type (type chuyên ñể làm phản ứng ngưng kết) 50 µl kháng huyết thanh và 450 µl canh trùng ñã chuẩn bị như trên, lắc nhẹ, ñem giữ ở Waterbath ở 50oC trong vòng 1 giờ, rồi ñọc kết quả. Phản ứng dương tính khi kháng huyết thanh và kháng nguyên kết hợp với nhau tạo nên kết tủa như cụm bơng ở đáy ống nghiệm. Phản ứng âm tính khi khơng thấy có kết tủa.
Các chủng dương tính với pha 1 được sử dụng tiến hành phản ứng Induction: Chuẩn bị mơi trường BHI (có 0,25% agar) đựng trong type nhỏ có nút vặn, trong type cho sẵn 1 ống thuỷ tinh nhỏ hở 2 ñầu. Sau khi hấp vô trùng,
giữ ở 50oC rồi cho kháng huyết thanh chuẩn Salmonella (Salmonella H sera for phase induction) vào type thí nghiệm, để ở nhiệt độ phịng. Cấy vi khuẩn cần kiểm tra trích sâu theo ống, ủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 h, sau đó kiểm tra kết quả. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn mọc chồi lên mặt thạch, thạch trong ống bị ñẩy lên cao hơn trong type. Phản ứng âm tính: chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đường cấy trích sâu, thạch trong ống khơng bị đẩy lên.
- Xác định kháng nguyên H, pha 2
Chỉ những chủng Salmonella dương tính với phản ứng Induction mới làm tiếp pha 2. Cấy chuyển chủng dương tính với phản ứng Induction vào ống canh thang BHI (5ml/type), ñể nghiêng trong tủ ấm trong vòng 6 giờ. Thêm vào ñó một lượng tương ứng dung dịch Saline ñể ở nhiệt độ phịng trong 2 giờ. Sử dụng kháng huyết thanh H dùng cho pha 2, tiến hành phản ứng và ñọc kết quả giống như pha 1.
Căn cứ vào kết quả giám định đặc tính sinh hóa và kết quả giám ñịnh huyết thanh, dựa vào hệ thống phân loại White-Kauffmann-Le Minor được mơ tả bởi Patrick và Francois-Xavier Weill (2007) ñể xác ñinh serotype
Salmonella.