VI NHÂN GIỐNG CÂY TRAI NAM BỘ
ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HO À SINH TRƯỞNG ĐẾN QUÁ TR ÌNH NUƠI CẤY PHÁT SINH TẾ
BÀO soma VÀ PHƠI VƠ TÍNH Ở CÂY HOA LAN
(Dendrobium, Phalaenopsis, Cymbidium )
Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh
PTNTĐ phía Nam về CNTBTV. Viện Sinh học Nhiệt đới
MỞ ĐẦU
Những kỹ thuật của cơng nghệ tế bào phát triển nhanh trong những năm gần đây. Phát sinh phơi soma và phát sinh hình thái là kỹ thuật nuơi cấy được ứng dụng nhiều
trong nhân nhanh các lồi cây trồng. Do vậy, nghiên cứu phát sinh và tái sinh in vitro là những nghiên cứu cơ bản ban đầu cho các ứng dụng về sau. H ơn nữa, kỹ thuật nuơi cấy dịng hĩa tế bào phơi hĩa in vitro từ nguồn nguyên liệu di truyền ban đầu xác định cho phép sản xuất một quần thể đồng đều cĩ đặc điểm di truyền giống nhau, khả năng tái sinh in vitro cao, sinh trưởng nhanh và đồng dạng (Wang etal. 2002). Dendrobium đ ược nuơi cấy tái sinh thành cơng từ tế bào soma (Meesawat và Kanchanapoom, 2002). Sagawa (1990ab) nuơi cấy tạo tế bào soma thành cơng. Ichihashi và Hiraiwa (1996)
nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của tế bào soma. Và Kobayashi etal (1993) tái sinh thành cơng tế bào soma. Phơi giả (PLB) của Cymbidium cũng đã được nuơi cấy
thành cơng của Begum etal (1994b), Huan và Tanaka (2004ab), Những nghiên cứu hiện đại về cơng nghệ tế bào thực vật đang tập trung nghiên cứu khả năng nuơi cấy phát sinh tế bào soma cĩ khả năng phơi hĩa. Trong quá trình nuơi cấy, mơi trường dinh dưỡng khống và các chất điều hịa sinh trưởng tác động một cách tích cực qua các giai đoạn phát triển in vitro. Trong cơng nghiệp hoa lan, giống là tiền đề phát triển, và cơng nghệ vi nhân giống chiếm vai trị phát triển các giống cây con chất l ượng cao cĩ giá thành hạ. Dendrobium, Phalaenopsis và Cymbidium cĩ thị trường tiêu thụ nội địa và xuất khẩu
vững chắc; tuy nhiên, cơng tác giống vẫn là rào cản đầu tiên để phát triển. Giống nhập hiện nay chủ yếu từ Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan với giá thành cây con cao. Giải
quyết kỹ thuật nhân giống nhanh là yêu cầu bức thiết để chủ động phát triển hoa lan thành ngành cơng nghiệp.
VẬTLIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
Giống: Dendrobium (D. Sonia 17) Phalaenopsis (P Sweet Candy) Cymbidium
(Cym Enzan Myth)
Mơi trường nuơi cấy: VW (Vacin and Went), cĩ bổ sung BA (6-benzyladenine), NAA (α-nathalene acetic acid), 2.4D (dichlorophenoxy acetic acid), TDZ (N -phenyl-N’- 1,2,3-thidiazol-5-yl-ure, thidiazol), nước dừa (CW), kinetin (6-fufurylaminopurine), peptone, than hoạt tính (AC)
Điều kiện nuơi cấy: nhiệt độ phịng 26+2oC, RH: 65%, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 33.3 μmol/m2/s
Phương pháp
Thực nghiệm được bố trí theo khối đầy đủ (RBD), cĩ 3 lần lập lại, mỗi lần cấy 5 bình. Sốliệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC (p=0.05). Chỉ tiêu theo dõi: khả năng phát sinh tế bào soma (%), khả năng phát sinh phơi giả PLB (protocorm like body), khả năng tái sinh chồi (%)
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phong lan (Dendrobium)
Nuơi cấy phát sinh tế bào soma: Mẫu nuơi cấy là chồi non, được cắt thành lát mỏng, nuơi cấy trên mơi trường VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + CW (10%) + peptone (1g/l) + sucrose (20g/l) + AC (1g/l). Sau thời gian 30 ngày nuơi cấy, tế
bào soma phát sinh trên vết cắt. Tỷ lệ tạo tế bào soma là 100% trên các mẫu nuơi
cấy. Tế bào soma, cĩ màu trắng sáng, dễ dàng nhân sinh khối
Nuơi cấy tăng sinh tế bào soma: Tế bào soma được nuơi cấy tăng sinh trên 6 mơi
trường thực nghiệm. Kết quả cho thấy, tế b ào soma tăng sinh m ạnh mẽ trên mơi trường VW + CW (10%) và VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + peptone (1g/l)
Nuơi cấy phát sinh và tăng sinh phơi gi ả (PLB): Tế bào soma tăng sinh đư ợc nuơi
cấy trên mơi trường thực nghiệm. Kết quả cho thấy, phơi giả phát sinh v à tăng sinh
nhanh trên mơi trường VW + CW (10%) và VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + CW (10%).
Nuơi cấy tái sinh PLB: Phơi giả cĩ khả năng tái sinh tr ên các mơi trường thực nghiệm. Hiệu quả trên mơi trường VW + peptone (1g/l) và VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + CW (10%)
Nhận xét: trên mơi trường cơ bản VW, các chất điều hịa sinh trưởng bổ sung BA, NAA kích thích phát sin h tế bào soma và phơi giả (bảng 1)
Hồ điệp (Phalaenopsis)
Nuơi cấy phát sinh tế bào soma: Mẫu nuơi cấy là phơi giả (PLB) in vitro được cắt
lớp mỏng. Lớp mỏng đ ược nuơi cấy trên mơi trường VW cĩ bổ sung 2.4D (0-0.1- 1mg/l), BA (0-0.01-0.1-1mg/l), sucrose (40g/l), CW (20%). Kết quả cho thấy sau 4
tuần: mơi trường VW + 2.4D (0.1mg/l) + BA (0.01mg/l) + sucrose (40g/l) thích hợp cho nuơi cấy phát sinh tế bào soma và PLB (bảng 2)
Nuơi cấy tăng sinh tế bào soma: Tế bào soma được nuơi cấy tăng sinh mạnh
mẽ trên mơi trường VW + 2.4D (0.1mg/l) + BA (0.01mg/l) + sucrose (40g/l) +
CW (20%) sau 4 tuần. Nước dừa kích thích q trình phân chia và biệt hĩa tế
bào.
Nuơi cấy phát sinh phơi giả (PLB): Tế bào soma được nuơi cấy phát sinh phơi giả trên mơi trường cĩ đường và khơng cĩ đường sucrose. Kết quả cho thấy sau 4 tuần: tế bào soma tiếp tục tăng sinh khối tr ên mơi trường VW + 2.4D
(0.1mg/l) + BA (0.01mg/l) + sucrose (40g/l) + CW (20%) và hình thành phơi gi ả trên mơi trường khơng đường VW + 2.4D (0.1mg/l) + BA (0.01mg/l) + CW (20%) (bảng 3)
Nuơi cấy tái sinh phơi giả (PLB): phơi giả được nuơi cấy tái sinh tr ên mơi trường VW + NAA (0.1mg/l) + BA (0.1mg/l) + CW (20%) + sucrose (20g/l) + AC (1g/l)
Nhận xét: Tế bào soma phát sinh và tăng sinh kh ối mạnh mẽ trên mơi trường VW
cĩ bổ sung 2.4D+BA+Sucrose và sự hình thành phơi giả khi khơng cĩ bổ sung
đường vào mơi trường. Phơi giả được tái sinh trên mơi trường
VW+BA+NAA+sucrose
Địa lan (Cymbidium)
Nuơi cấy phát sinh v à tăng sinh tế bào soma: Phơi giả in vitro được cắt thành
lát mỏng và được nuơi cấy tr ên mơi trường VW + 2.4D (0.1mg/l) + Kinetin (0.1mg/l) + peptone (1g/l) + sucrose (30g/l). Tế bào soma phát sinh sau 30
ngày nuơi cấy, tỷ lệ phát sinh đạt 50-60% trên số mẫu nuơi cấy. Tế bào soma
được tách ra và nuơi cấy tăng sinh mạnh mẽ trên cùng mơi trư ờng, thời gian giữa hai lần cấy truyền 30 ngày.
Nuơi cấy phát sinh phơi giả (PLB): Tế bào soma được nuơi cấy trên hai mơi
trường phát sinh phơi: VW + NAA (0.1mg/l) + Kinetin (0.1mg/l) + peptone
(1g/l) + sucrose (20g/l) và VW + NAA (0.1mg/ l) + TDZ (0.1mg/l) + peptone (1g/l) + sucrose (20g/l). Kết quả cho thấy: phơi giả hình thành sau 50 ngày nuơi cấy trên cả hai mơi trường, cho tỷ lệ hình thành phơi giả cao >90% (bảng 4)
Nhận xét: Mơi trường VW cĩ bổ sung NAA+Kinetin(+TDZ)+ Kinetin+CW quyết
định đến quá trình phát sinh và tăng sinh tế bào soma và PLB
KẾT LUẬN
Mơi trường VW bổ sung BA, NAA, kinetin, TDZ, n ước dừa, đường sucrose thích
hợp cho nuơi cấy phát sinh v à tăng sinh tế bào soma, phát sinh và tái sinh phơi giả
(PLB). Cơng nghệ tế bào soma là cơng nghệ nền cho nhân giống cơng nghiệp trong bioreactor
Bảng 1: Khả năng nuơi cấy phát sinh v à tăng sinh tế bào soma, phát sinh phơi gi ả (PLB) và tái sinh trên lồi phong lan dendrobium
Các giai đoạn nuơi cấy Mơi trường nuơi cấy Kết quả
Nuơi cấy phát sinh tế bào soma
Sau 4 tuần Tế bào soma hình thành trên mặt cắt.
VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + CW (10%) + peptone (1g/l) + sucrose (20g/l)
Tỷ lệ hình thành tế bào soma 100%
Nuơi cấy tăng sinh tế bào soma
Sau 4 tuần Tăng sinh tế bào soma / 100mg nuơi cấy ban đầu
VW 55 a VW + CW (10%) 82 ab VW + peptone (1g/l) 95 ab VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) 61 a VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + CW (10%) 102 ab VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + peptone (1g/l) 115 b
Nuơi cấy phát sinh và tăng sinh phơi giả (PLB)
Sau 8 tuần Tăng sinh phơi giả / 100mg nuơi cấy ban đầu
VW 45 + 15 ab VW + CW (10%) 124 + 48 d VW + peptone (1g/l) 51 + 20 ab VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) 46 + 12 a VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + CW (10%) 215 + 51 cd VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + peptone (1g/l) 122 + 43 bc
Nuơi cấy tái sinh chồi Sau 12 tuần Số chồi / 1mg PLB
VW 7.2 ns VW + CW (10%) 3.2 ns VW + peptone (1g/l) 16.1 ns VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) 6.8 ns VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + CW (10%) 10.6 ns VW + BA (1mg/l) + NAA (0.3mg/l) + peptone (1g/l) 0.0
Bảng 2: Sự hình thành tế bào soma và phơi gi ả (PLB) trên hoa lan hồ điệp
PGR (mg/l) Mẫu nuơi cấy
Suc
2.4D BA
CW
(%) Tổng số mẫu Cal(+++) Cal(++) Cal(+) Cal+PLB PLB
40 0 0 25 4.5 10 6.5 2 40 0.1 0 25 9 4.5 7 1.2 40 0.1 0.01 25 2 9 8.5 2 2.2 40 0.1 0.1 25 0.2 2.5 11 1 1 40 1 0 25 1 5 3 2.5 0 40 1 0.1 25 0 6.5 7.5 1.5 2.2 40 1 1 25 0 5 7 2 1.5 0 0 0 20 25 0 0 0 0 24 40 0 0 20 25 13 5.5 2.5 3.5 0
Cal(+++): tế bào soma màu vàng lớn, Cal(++): tế bào soma màu vàng nhỏ, Cal(+): tế bào soma
màu vàng rất nhỏ, PLB: phơi giả
Bảng 3: Sự hình thành phơi gi ả (PLB)
Sucrose (g/l) Tăng sinh khối tế bào soma (số lượng/ 100mg.cụm)
Tổng số mẫu Tăng sinh tế bào soma Phơi giả (PLB)
0 25 0 25
Bảng 4: Sự hình thành phơi gi ả
Mẫu nuơi cấy % PLB Số PLB/mẫu % Tế bào soma
PLB 92.2a 7.8a 1.8b
86.4b 4.2b 5.9a
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Begum AA, M Takami, M Tahara, S Sako. Somatic embryogenesis in Cymbidium
through in vitro culture of inner tissue of protocorm -like body. J. Japan Soc. Hort. Sci. Vol63, pp419-427, 1994a
2. Begum AA, M Takami, S Kato. Formation of protocorm -like body and shoot
development through in vitro culture of outer tissue of Cymbidium. . Japan Soc.
Hort. Sci. Vol63, pp663-673, 1994b
3. Meesawat U, K Kanchanapoom. In vitro plant regeneration through embryogenesis
and organogenesis from callus culture of pigeon orchid ( D. crumenatum Sw.).
Thamasat Intl.J. Sc.Tech. Vol7, No2, pp9 -17, 2002
4. Huan LVT, M Tanaka. Effec ts of red and blue light emitting diodes on callus induction, callus proliferation and protocorm -like body formation from callus of Cymbidium orchid. Emviron. Controll Biol. Vol42, pp57 -64, 2004a
5. Huan LVT, M Tanaka. Callus induction from protocorm -like body segments and plant
regeneration in Cymbidium. Emviron. Controll Biol. Vol79, pp406 -410, 2004b
6. Ichihashi S, H Hiraiwa. Effects of solidifiers, coconut water, carbohydrate source
on growth of embryogenic callus in Phalaenopsis and allied genera. J. Orchid Soc.
India, Vol10, pp81-88, 1996
7. Ishii Y, T Takamura, M Goi, M Tanaka. Callus induction and somatic embryogenesis of phalaenopsis. Plant cell report, Vol17, pp446 -450, 1998
8. Jaime A, T da Sylva, N Singh, M Tanaka. Priming biotic factors for optimal
protocorm like body (PLB) and callus induction in hybrid Cymbidium and
assessment of cytogenetic stability in regenerated plantlet. Plant cell, tissue, and organ culture, Vol84, pp135 -144, 2006
9. Kobayashi S, T Kameya, S Ichihashi. Plant regeneration from protoplast s derived
from callus of Phalaenopsis. Plant Tissue Cult. Letters, Vol10, pp267 -270, 1993
10. Sagawa Y. Biotechnology in orchid. In: KimuraT, S Ichihashi, H Nagata (eds) Proc. Nagaya Intl. Orchid Show 1990. NIOS, Kariya, pp46 -48, 1990a
11. Sagawa Y. Orchid, other considerations. In: Ammirato PV, DA Evans, WR Sharp, YSP Bajaj (eds) Handbook of plant cell culture, Vol5. McGraw -Hill, New York, pp638-653, 1990b
12. Wang Z, D Lehmann, J Bell, A Hopkins. Development of an efficient plant regeneration system for Russian wildr ye. Plant cell report, Vol20, pp797 -801, 2002
SUMMARY