VI NHÂN GIỐNG CÂY LIM XANH
THƠNG ĐỎ (Taxus wallichiana Zucc)
Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh
PTNTĐ phía Nam về CNTBTV, Viện Sinh học Nhiệt đới
MỞ ĐẦU
Cây thơng đỏ là lồi cây quý hiếm được sử dụng trong dược liệu. Trên đỉnh Liang
Biang hiện nay số lượng cịn lại rất ít, đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt diệt. Cây thơng
đỏ nằm trong Sách Đỏ Việt Nam (Bộ KH&CN, 2000). Phục hồi lại rừng thơng đỏ hiện
nay chủ yếu dựa vào phương pháp giâm cành truy ền thống, chồi ngọn mang tính ưu thế ngọn mạnh mẽ (Pierik, 1987) và cây con bầu đất thường cĩ độ ngả nghiêng cao. Cây
thơng đỏ lại sinh trưởng chậm, nên khả năng khai thác thơng đỏ và sử dụng cho cơng nghiệp dược địi hỏi thời gian lâu. Phục hồi và phát triển cây thơng đỏ là một thách thức lớn đối với khoa học (Coke, 1996). Nghiên cứu kỹ thuật nuơi cấy đỉnh sinh tr ưởng nhằm mục tiêu bảo tồn (Mantell etal., 1985) và phát triển cây thơng đỏ là hướng nghiên cứu khả thi.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPVật liệu Vật liệu
Mẫu nuơi cấy: cây thơng đỏ bầu đất được giâm cành (được thu thập ở vùng núi
Liang Biang, Đà Lạt) được 10 tháng tuổi.
Điều kiện nuơi cấy: mơi trường được vơ trùngở 121oC và 1at trong 25 phút. Nhiệt
độ phịng nuơi cấy 28+1oC. Cường độ chiếu sáng 34,2mol/m2
/s. Thời gian chiếu sáng 8giờ/ngày
Mơi trường nuơi cấy: mơi trường dinh dưỡng khống cơ bản MS (Murashige- Skoog, 1962) và WPM (Lloyd and McCown, 1981), B5 (Gamborg, 1986), WV3 (Coke,
1996), được bổ sung BA (6-benzyl aminopurine), Kinetin (6 -furfurylaminopurine), IBA (-indol butyric acid), NAA (α - naphthalene acetic acid), glyc in (5mg/l), vitamin B1 (5mg/l) và nước dừa (CW). Chất chống hĩa nâu: AC (than hoạt tính), PVP
(polyvinylpyrolidon) và AgNO3
Phương pháp
Thí nghiệm được bố trí theo RCBD (1 yếu tố), 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại nuơi cấy 5 bình tam giác 300ml, mỗi bình tam giác chứa 65ml mơi trường thí nghiệm và được
(P=0.05). Đường kính mơi trường dưới gĩc thân bị hĩa nâu (mm), tỷ lệ mẫu nuơi cấy phát sinh chồi (%), số chồi / mẫu (chồi), số chồi / bình (chồi), chiều cao chồi (mm)
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Vơ trùng mẫu nuơi cấy: Mẫu nuơi cấy được lấy từ cây mẹ bầu đất 18 tháng tuổi. Chồi đỉnh và chồi bên được sử dụng làm mẫu nuơi cấy. Chồi non đ ược vơ trùng hypochlorite-Na (10%) trong 15 phút. Chồi vơ trùng được đưa vào nuơi cấy in vitro
Ảnh hưởng của mơi trường khống cơ bản đến nuơi cấy phát sinh chồi thơng đỏ in vitro: Chồi non được nuơi cấy trên mơi trường khống cơ bản MS, WPM, B5, WV3 cĩ
bổ sung BA (5mg/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy, mơi trường khống cơ bản MS (nghiệm thức A1) tỏ ra thích hợp
Ảnh hưởng của chất chống hĩa nâu đến nuơi cấy phát sinh chồi thơng đỏ in vitr o:
Cây thơng đỏ thường cĩ nhựa đỏ khi bị tạo vết th ương. Chồi non đưa vơ cấy sau 2 ngày
thì thấy xuất hiện nhựa đỏ tiết ra mơi tr ường nuơi cấy làm hạn chế khả năng phát sinh chồi. Trên mơi trường nuơi cấy MS + BA (5mg/l) cĩ bổ sung than hoạt tính, PVP và AgNO3. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ sung than hoạt tính (1000mg/l), PVP (150mg/l) và AgNO3 (150mg/l) đã hạn chế rõ rệt sự tiết nhựa loang v ào mơi trường nuơi cấy. Trong đĩ AgNO3 tỏ ra hiệu quả
Ảnh hưởng của sinh lý mẫu nuơi cấy đến phát sinh chồi thơn g đỏ in vitro: Sinh lý
mẫu nuơi cấy cĩ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát sinh chồi bên và chồi bất định. Sinh lý mẫu nuơi cấy được thực nghiệm với nhiều loại mẫu nuơi cấy: (1) ngọn chính +
đột 1 (2) thân chính + đốt 2 (3) thân chính + đốt 3 (4) ngọn cành + đốt 1 (5) thân cành +
đốt 2 (6) thân cành + đốt 3. Mẫu được nuơi cấy trên mơi trường phát sinh chồi MS +
BA (5mg/l) + AgNO3 (150mg/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy chồi phát sinh cao nhất ở mẫu (1) và (2), cĩ số chồi / mẫu nuơi cấy: 1,5 và 3 chồi
Ảnh hưởng của tuổi mẫu nuơi cấy đến phát sinh chồi thơng đỏ in vitro: Tuổi mẫu nuơi cấy chiếm vai trị quan trọng, mẫu phải non và đủ độ trưởng thành cần thiết, sẽ cho phát sinh chồi cao. Mẫu nuơi cấy cĩ tuổi sinh lý 12-15-18 tháng, được nuơi cấy trên mơi
trường phát sinh chồi MS + BA (5mg/l) + AgNO3(150mg/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ chồi phát sinh cao nhất với tuổi mẫu 18 tháng, và cho số chồi nhiều / mẫu nuơi cấy (3,1 chồi)
Ảnh hưởng của BA đến phát sinh chồi thơng đỏ in vitro: Với mơi trường nuơi cấy
cơ bản MS cĩ bổ sung nồng độ BA (0,5-2,5-5,-10,-15mg/l) + AgNO3 (150mg/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy BA (5mg/l) thích hợp cho nuơi cấy phát sinh chồi
Ảnh hưởng của BA và kinetin đến phát sinh chồi thơng đỏ in vitro: Nhằm nâng cao khả năng nuơi cấy phát sinh chồi, tổ hợp BA (5mg/l) + Kin (0,1-0,5-1,-2,5-5mg/l) + AgNO3 (150mg/l) được bổ sung vào mơi trường nuơi cấy MS. Kết quả nghiên cứu cho thấy tổ hợp BA (5mg/l) + Kin (1mg/l) + AgNO3 (150mg/l) thích hợp cho nuơi cấy phát sinh chồi, cĩ số chồi / mẫu nuơi cấy nhiều (3,1 chồi)
Ảnh hưởng của mẫu nuơi cấy đến tỷ lệ ng ả nghiêng chồi thơng đỏ in vitro: Cây
thơng đỏ cĩ đặc tính khi giâm c ành bên ngồi vườn ươm thường cĩ tỷ lệ cây ngả nghiên cao. Mơi trường nuơi cấy phát sinh chồi là MS + BA (5mg/l) + K in (1mg/l) + AgNO3 (150mg/l). Mẫu nuơi cấy (1) đỉnh thẳng đứng (2) thân thẳng đứng (3) đỉnh cành (4) thân cành. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ ngả nghiêng cao khi mẫu nuơi cấy là (3) và (4)
so với độ thẳng đứng của trục tung (0o) là >45o, mẫu (1) và (2) cĩ tỷ lệ ngả nghiêng <45o. Vậy nuơi cấy thích hợp in vitro l à (1) đỉnh thẳng đứng (2) thân thẳng đứng
Ảnh hưởng của tính bảo lưu cục bộ đến sinh trưởng chồi thơng đỏ in vitro: Trong giâm cành, với mẫu là cành (nhánh) bên, thư ờng cho cây phát triển ng ả nghiêng. Nghiên cứu tính bảo lưu cục bộ in vitro cho thấy: tr ên mơi trường nuơi cấy cơ bản MS + BA (5mg/l) + Kin (1mg/l) + AgNO3 (150mg/l), với mẫu nuơi cấy là (1) đỉnh cành và (2) thân cành, cho kết quả: gĩc nghiêng so với trục tung (0o), mẫu nuơi cấy đỉnh cành (1) cĩ tỷ lệ ngả nghiêng thấp
Ảnh hưởng của điều kiện nuơi cấy thơng khí v à cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng chồi thơng đỏ in vitro: Trên mơi trường nuơi cấy phát sinh chồi c ơ bản MS +
BA (5mg/l) + Kin (1mg/l) + AgNO3 (150mg/l), mẫu là thân chính + đốt 2 được sử dụng trong nuơi cấy, sử dụng nắp giấy và nắp cao su, trong điều kiện chiếu sáng 11,4-22,8- 34,2mol/m2
/s, kết quả nghiên cứu cho thấy trong điều kiện chiếu sáng 11,4- 22,8mol/m2
/s và đậy bằng nắp giấy cho phát sinh chồi cao (2,8 chồi)
Nhân nhanh cây thơng đỏ in vitro: Chồi non phát sinh trong nuơi cấy đ ược sử dụng
làm protocol cho quá trình vi nhân giống. Trên mơi trường cơ bản MS cĩ bổ sung BA, K.
Kết quả nghiên cứu cho thấy mơi trường nghiệm thức E2: MS + BA (5mg/l) + Kin (1mg/l) cho phát sinh chồi cao (3,4 chồi / cụm ). Cây thơng đỏ in vitro, cĩ tính ưu thế ngọn mạnh mẽ, nuơi cấy đốt thân cho phát sinh chồi, nuơi cấy chồi đỉnh chỉ cho v ươn thân
Nuơi cấy phát sinh rễ chồi thơng đỏ in vitro: Cây con thơng đỏ phát sinh rễ in vitro trên mơi trường nuơi cấy WPM + NAA (1mg/l) Rhizopon (50mg/l) sau 75 ngày nuơi cấy
KẾT LUẬN
Chồi đỉnh và đốt thân cây thơng đỏ (1-2 năm tuổi) được sử dụng trong nuơi cấy in vitro. Chồi non phát sinh sau 45 ngày nuơi cấy trên mơi trường MS + BA (5mg/l). Chồi
non tái sinh được sử dụng làm propagules trong vi nhân giống trên mơi trường MS +
BA (5mg/l) + Ki (1mg/l). Chồi non được nuơi cấy phát sinh rễ tr ên mơi trường WPM +
NAA (1mg/l) + Rhizopon (50mg/l) sau 75 ngày nuơi cấy. AgNO3 thích hợp cho nuơi
cấy ức chế sự hĩa nâu mẫu. Chồi đ ỉnh chiếm nhiều ưu thế trong quá trình phát sinh và
sinh trưởng của chồi bên. Nuơi cấy chồi đỉnh được xem là kỹ thuật hiệu quả trong bảo
tồn lồi thơng đỏ ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ KH&CN (2000). Sách Đỏ Việt Nam, phầnThực vật. NXB KH&KT, Hà Nội 2. Coke J. E. (1996). Basal medium for in vitro cultures of loblolly pine. US Patent
3. Gamborg O. L. (1986). Protoplasts and plant regeneration in culture. In: Demain AL, Solomon NA (eds) Manual of industrial microbiology and biotechno logy. American Society for Microbiology, Washington, DC
4. Lloyd G. & B. McCown (1980). Commercially feasible micropropagation of laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. Comb. Proc. Int. Plant Crop Soc . 30:421-427
5. Mantell S. H., Matthews J. A. & McKee R. A. (1985). Principles of plant biotechnology. Blackwell Scietific, Boston, pp130 -157
6. Murashige T. & R. Skoog (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:431-497
7. Philips G. C. (1988). Development models for the expression of totipotency and plant regeneration in vitro. South Assoc. Sci. Bull. Biochem. Biotech . 1: 12-16 8. Pierik R. L. M. (1987). In vitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff,
Dordrecht, pp183-230
SUMMARY