VI NHÂN GIỐNG CÂY LIM XANH
(Artemisia annua L.) invitro
Phạm Thế Anh, Lê Thi Hiền,Bùi Thi Tường Thu, Trần Văn Minh
PTNTĐ phía Nam về CNTBTV, Viện Sinh học Nhiệt đới
MỞ ĐẦU
Thực vật là nguồn dược phẩm quan trọng từ h àng ngàn năm nay. WHO ư ớc tính khoảng 80% dân số vẫn dựa chủ yếu v ào các phương thuốc truyền thống như thảo dược trong chữa trị bệnh. Các loại tân d ược ngày nay cũng cĩ nguồn gốc từ thực vật. Khoảng một phần tư các loại thuốc được kê toa chứa các chiết xuất từ thực vật. Thuốc chữa sốt rét hữu hiệu nhất hiện nay l à artemisinin được chiết xuất từ cây thanh hao hoa vàng.
Thanh hao (Artemisisa annua L.) cĩ nguồn gốc Châu Á (Trung Quốc, Việt Nam), hiện nay là một loại cây rất phổ thơng cĩ mặt ở nhiều n ơi trên thế giới, mọc tốt ở khí hậu ơn đới hay cao nguyên. Ở Việt Nam, theo kết quả điều tra cụ thể của Viện D ược
liệu từ năm 1986-1990, đã phát hiện thanh cao hoa vàng mọc tự nhiênở 4 tỉnh, thuộc 20
huyện- thị xã và hơn 70 xã
Phương pháp sản xuất artemisinin từ cây thanh hao ngoài tự nhiên phụ thuộc vào sản lượng thu hoạch cây thanh hao hay thời tiết. Cơng nghệ sinh học đĩng vai trị quan trọng trong việc lựa chọn, nhân giống và bảo tồn các nguồn gen của cây thuốc quý (Hara etal, 1998). Kỹ thuật tái sinh invitro nắm giữ tiềm năng to lớn trong việc tạo ra
các nguồn thực vật làm thuốc cĩ chất lượng cao (Nalammai & Chan, 2004). Các hợp chất thứ cấp được thu nhận thơng qua nuơi cấy tế bào soma, tế bào dịch huyền phù đĩ
được nghiên cứu từ nhiều loài cây thuốc (Chan & Nalammai, 2001). Trong bài báo này chúng tơi nghiên cứu vấn đề chọn dịng cây thanh hao invitro, qua đĩ làm nguồn nguyên
liệu cho việc nuơi cấy tế bào soma từ thân, lá, rễ nhằm mục tiêu sản xuất artemisinin phịng chống bệnh sốt rét.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Mẫu nuơi cấy: Thanh hao (Artemisia annua L.) thực sinh chọn lọc được lấy từ
Trung tâm Dược liệu Đà Lạt (Lâm Đồng). Mẫu là những mảnh lá cắt thành đoạn 2-3cm được vơ trùng bằng Na-hypochlorite (1-5%) trong 10 phút và đư ợc nuơi cấy trong ống
nghiệm. Sau nuơi cấy 10 ngày, những mẫu khơng nhiễm đ ược đưa vào nuơi cấy tái sinh trực tiếp trên mơi trường MS + BA (0,5mg/l) + Kinetin (0,5mg/l). Sau 30 ngày nuơi cấy, cụm chồi non invitro phát sinh. Những chồi non này được sử dụng làm nguyên liệu
Điều kiện nuơi cấy: mơi trường vơ trùngở 121oC và 1at trong 25 phút. Nhiệt độ phịng nuơi cấy 28±2oC. Cường độ chiếu sáng 34,2µmol/m2/s. Thời gian chiếu sáng 8giờ/ngày.
Mơi trường nuơi cấy: Mơi trường khống cơ bản MS (Murashige-Skoog, 1962), LV
(Phillips-Collins, 1979) cĩ bổ sung đường sucrose, và các chất điều hồ sinh trưởng
như: BA (6-benzyladenine), Kinetin (6 -furfurylaminopurine), NAA (-naphthalene
acetic acid ), 2.4D (2.4-dichlorophenoxy acetic acid).
Phương pháp
Thí nghiệm được bố trí theo CBD (1 yếu tố), 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại nuơi cấy 5 bình tam giác 300ml, mỗi bình tam giác chứa 65ml mơi trường thí nghiệm và được cấy 5 mẫu. Số liệu thu thập đ ược phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC (P=0.05) sinh khối tế bào sau nuơi cấy (g), chiều cao chồi (mm)
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chọn lựa và khảo sát sinh trưởng và phát triển trên mơi trường nuơi cấy MS và LV:
Để xác định mơi trường khống thích hợp nuơi cấy cây thanh hao invitro. Các chồi non
cây thực sinh bầu đất được vơ trùng bằng hypochlorite-Na (5%) trong 10 phút. Chồi non vơ trùng được đưa vào nuơi cấy trên hai mơi trường khống MS và LV. Theo dõi và đánh giá khả năng tạo chồi sau 30 ngày nuơi cấy. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Mơi
trường khống cơ bản MS và LV khơng cĩ bổ sung chất điều hịa sinh trưởng đều cĩ
khả năng phát sinh chồi cây thanh hao. Tuy nhi ên mơi trường LV là thích hợp hơn với lá cây mọc to hơn, vươn thẳng, xanh tốt
Chọn dịng cây thanh hao: Trong thí nghiệm trên quan sát thấy cĩ hai dịng cây thanh hao khác nhau. Một dịng cao, thân chắc, lá vươn thẳng; một dịng thân thấp. Theo
nhiều tài liệu ghi nhận dịng thân cao sẽ cho hàm lượng artemisinin cao hơn, do đĩ chúng tơi chọn những cây này làm vật liệu cho những thí nghiệm kế tiếp. Dịng thanh hao thân
cao được nuơi cấy nhân giống in vitro tr ên mơi trường LV + BA (0-0,1-0,3-0,5-0,7mg/l).
Chúng tơi nhận thấy với nồng độ BA thấp (0,3mg/l) chồi phát triển cả về chiều cao và số
lượng. Chồi xanh tốt, thân chồi vươn thẳng, lá to. Trong khi đĩ, ở mơi tr ường cĩ BA (0.5mg/l) và BA (0,7mg/l), chồi phát triển khơng bình thường, lá xoăn, thân mọng nước.
Do đĩ mơi trường cĩ bổsung BA (0,3mg/l) thích hợp cho sự nhân chồi
Ảnh hưởng của BA, NAA và 2,4 D đến khả năng nuơi cấy phát sinh tế bào soma:
Mơi trường nuơi cấy LV cĩ bổ sung BA, NAA, và 2.4D riêng rẽ với nồng độ sử dụng cho mỗi loại chất là 0-0,1-0,5-0,7-1mg/l. Kết quả nghiên cứu cho thấy, BA, NAA và 2.4D riêng rẽ khơng kích thích phát sinh tế bào soma và bổ sung NAA và 2.4D riêng rẽ cho thấy kích thích tạo rễ (bảng 3)
Ảnh hưởng phối hợp của BA v à NAA đến khả năng nuơi cấy phát sinh tế bào soma:
Mơi trường khống LV cĩ bổ sung BA (0,1-0,5-0,7-1,1,5-2,-2,5mg/l) và NAA (0,1-0,3- 0,5-0,7-1-1,5-2mg/l) được sử dụng trong nghiên cứu nuơi cấy phát sinh tế bào soma trên thân lá rễ cây in vitro đưa vào nuơi cấy. Trong đĩ nghiệm thức LV + BA (0,5mg/l) + NAA (0,5mg/l) cho phát sinh tế bào soma đồng đều. Với mẫu nuơi cấy từ mảnh lá, tế
bào soma cĩ màu trắng xanh, mịn, xốp. Với mẫu nuơi cấy từ thân, tế bào soma cĩ màu trắng xanh. Với mẫu nuơi cấy từ rễ, tế bào soma cĩ màu vàng trắng, xốp
Ảnh hưởng của BA, NAA và 2.4D đến khả năng nuơi cấy t ăng sinh tế bào soma:
Mơi trường khống LV cĩ bổ sung riêng rẽ BA (0,1-2,5mg/l), NAA (0,1-2,5mg/l) và 2.4D (0,1-2,5mg/l) trong nghiên cứu nuơi cấy tăng sinh tế bào soma. Kết quả nghiên cứu cho thấy, mơi trường khống LV cĩ bổ sung BA (1mg/l) hay NAA (1mg/l) hay 2.4D (1mg/l) cho khả năng tăng sinh tế bào lần lượt 10.670mg/cụm, 10.500mg/cụm, 10.830mg/cụm. Điều này cho phép nhận xét rằng BA, NAA v à 2.4D đã cĩ tác động
kích thích tăng sinh t ế bào soma
Ảnh hưởng phối hợp BA và NAA đến khả năng nuơi cấy tăng sinh tế bào soma: Mơi
trường khống nuơi cấy LV cĩ bổ sung BA (0,1-2,5mg/l) kết hợp với NAA (0,1-
2,5mg/l) được sử dụng trong nghiên cứu nuơi cấy tăng sinh tế bào soma. Kết quả nghiên cứu cho thấy mơi trường thích hợp cho nuơi cấy tăng sinh là LV + BA (0,5mg/l) + NAA
(0,5mg/l). Trên mơi trư ờng nuơi cấy này, tế bào soma cĩ nguồn gốc từ lá hay thân, sau
khi tiếp tục cấy truyền sẽ mất đi màu xanh diệp lục, và chuyển sang màu vàng tơi xốp
Ảnh hưởngcủa điều kiện chiếu sáng đến quá trình nuơi cấy tế bào soma: Các mẫu
nuơi cấy tế bào soma được đặt trong 2 điều kiện mơi tr ường: (a) mơi trường được che tối (b) mơi trường được đặt trong điều kiện 8 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 26-28oC.
Xác định điều kiện nuơi cấy thích hợp nhất cho sự nuơi cấy tế bào soma. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Trong điều kiện chiếu sáng, cụm tế bào soma chuyển dần sang màu vàng
đậm, tế bào hơi rắn lại, vĩn cục, và chuyển sang màu nâu sau 2 tuần nuơi cấy. Ngược
lại, khi được đặt trong điều kiện tối, cụm tế bào soma cĩ màu vàng trắng, tơi, xốp. Nhưng nếu khơng được cấy truyền sau 1 tháng thì cụm tế bào soma này cũng chuyển
sang màu vàng đậm rồi hĩa nâu.
Khả năng tạo artemisinin: Trong quá trình nuơi cấy phát sinh tế bào soma từ lá cây
thanh hao in vitro trên mơi trư ờng MS + BA (0,5mg/l) + NAA (0,5mg/l) xuất hiện 3 dạng tế bào soma sau 3 tuần nuơi cấy: (a) tế bào soma cĩ màu trắng vàng nhạt và xốp (b) tế bào soma cĩ màu xanh diệp lục và cứng (c) tế bào soma cĩ màu nâu nhạt. Kiểm tra artemisinin bằng kỹ thuật chạy điện di lớp mỏng (TLC - thin layer chromatography)
đều cho thấy cĩ sự hiện diện. Khảo sát sự tăng sinh tế bào và phân tích artemisinin bằng
kỹ thuật HPLC cho thấy h àm lượng artemisinin tế bào soma màu xanh diệp lục > màu trắng vàng nhạt > màu nâu. Kết quả này cho thấy sự cần thiết của nuơi cấy tế bào soma
trong điều kiện cĩ chiếu sáng trong điều kiện bán rắn và lỏng. Qua nghiên cứu đường
cong sinh trưởng của tế bào soma trong nuơi cấy lỏng cho thấy từ tuần thứ 1-3 tế bào
tăng sinh mạnh mẽ, và từ tuần thứ 3 trở đi sự tăng sinh khối bắt đầu đi v ào giai đoạn ổn định (stationary phase) l à giai đoạn sinh tổng hợp artemisinin. Phân tích h àm lượng artemisinin trong giai đo ạn nuơi cấy tăng sinh mạnh mẽ cho thấy h àm lượng tăng theo
thời gian từ 3-6-9-18 ngày sau nuơi cấy. Điều này cho thấy hàm lượng artemisinin tổng hợp được xuất hiện trong giai đoạn nuơi cấy tăng sinh.
KẾT LUẬN
Với việc chọn dịng cây thanh hao invitro, cùng với việc nuơi cấy tế bào soma từ
các bộ phận của cây (lá, thân, rễ), hy vọng sẽ mở ra một h ướng mới trong việc nghiên cứu sản xuất artemisinin bằng kỹ thuật nuơi cấy tế bào nhằm gúp phần phịng chống bệnh sốt rét.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hara Y., Y. Yukimune, J. Hiratsuka, T. Nakano, K. H. T. Chris & L. K. Chan (1998). Studies in tissue and cell culture of medicinal plants. In: JBA & NEDO (eds) Proceedings of the Tokyo international forum on conservation and sustainable use of tropical bioresources . Pp236-238. Tokyo, Japan
2. Chan L. K. & S. Nalammai (2001). Preparation of cell suspension of Artemisia annua. In: Proceedings of the seminar on me dicinal plants - Towards of modernization of rsearch and technology in herbal industries . Pp277-281. Kepong Selangor, Malaysia
3. Nalammai S. & L. K. Chan (2004). Effect of type of callus, MS -sugar and pH on cell suspension of Artemisia annua, an antimalarial plant. In: Chang YS, M Mastura
& MY Nurhanan (eds) Proceedings of the seminar on Tongkat ali, Kacip fatima and Pagaga new dimension in complimentary health care. Pp109-113. FRIM,
Kuala Lumpur, Malaysia
4. Murashige T. & R. Skoog (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 431-497
SUMMARY