VI NHÂN GIỐNG CÂY TRAI NAM BỘ
ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ PHƠI soma TRONG CƠNG TÁC GIỐNG CÂY TRẦM H ƯƠNG
(Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte)
Đinh Trung Chánh,ĐH Nơng Lâm TPHCM
Bùi Thị Tường Thu,PTNTĐ phía Namvề CNTBTV
Trần Văn Minh, Viện Sinh học Nhiệt đới
MỞ ĐẦU
Cây trầm hương là lồi cây đặc sản ở vùng nhiệt đới. Đặc điểm sinh tinh dầu trầm
hương là sản phẩm khai thác chủ yếu. Quá trình hình thành và cơ chế tạo trầm hương đến nay vẫn là điều bí ẩn. Với giá trị kinh tế cao, cây trầm h ương hiện nay đang đứng
trước nguy cơ tuyệt diệt (Bộ KH&CN, 2000). Với những cây trầm h ương đầu dịng hiện
nay cịn rất ít trong các cánh rừng nguyên sinh. Phục tráng giống và dịng hĩa dịng vơ tính bằng kỹ thuật nuơi cấy phơi soma là rất cần thiết (Pierik, 1987). Với kỹ thuật nuơi cấy phơi soma, cây trầm h ương được phục tráng và trở về trạng thái trẻ nhanh chĩng (Thorpe, 1980). Với trạng thái trẻ, cây trầm h ương đầu dịng là nguồn cung cấp nguyên liệu cho quá trình phát triển vườn giống đầu nguồn cung cấp nguyên liệu cho phát triển các vùng chuyên canh trầm hương xuất khẩu.
VẬTLIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Mẫu nuơi cấy: cây trầm hương in vitro, dịng ND (được thu thập ở nam đảo Phú
Quốc). Mẫu cây con in vitro đ ược chọn đang sinh trưởng khỏe và cĩ thân lá rễ đầy đủ. Thân lá rễ cịn non được sử dụng trong nuơi cấy. Thân và rễ được cắt từng đọn 1cm, lá
được cắt thành từng mảnh 1cm2
Điều kiện nuơi cấy: Mơi trường được vơ trùngở 121oC và 1at trong 25 phút. Nhiệt độ phịng nuơi cấy 28+1oC. Cường độ chiếu sáng 34,2mol/m2
/s. Thời gian chiếu sáng 8giờ/ngày
Mơi trường nuơi cấy: Mơi trường dinh dưỡng khống cơ bản MS (Murashige-
Skoog, 1962) và WPM (Lloyd and McCown, 1981), đư ợc bổ sung BA (6-benzyl
aminopurine), IAA (-indol acetic acid), IBA (-indol butyric acid), NAA (α-
naphthalene acetic acid), glycin, vitamin B1 và nư ớc dừa (CW)
Phương pháp
Thí nghiệm được bố trí theo RCBD (1 yếu tố), 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại nuơi cấy 5 bình tam giác 300ml, mỗi bình tam giác chứa 65ml mơi trường thí nghiệm và được
cấy 5 mẫu. Số liệu thu thập đ ược phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC (P=0.05). Tỷ lệ phát sinh tế bào soma (%), sinh khối tế bào sau 15, 30 ngày nuơi cấy (g), độ tăng sinh khối (g), mật độ tế bào (tbx104/ml)
KẾT QUẢ, THẢO LUẬN
Nuơi cấy phát sinh tế bào soma: thân lá rễ là bộ phận được sử dụng làm mẫu nuơi
cấy. Mẫu nuơi cấy được đặt trên bề mặt thạch, cĩ vết cắt tiếp xúc với mơi tr ường nuơi cấy. Mơi trường cơ bản MS được sử dụng, cĩ bổ sung BA, kinetin, NAA, IBA, 2.4D, vitamin B5. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phát sinh tế bào soma cao với mẫu nuơi cấy là rễ (dịng ND, nam đảo Phú Quốc). Trên mơi trường nuơi cấy cĩ bổ sung 2.4D, tế
bào soma phát sinh nhanh, cĩ màu trắng trong; mơi trường cĩ bổ sung BA + NAA +
Kin + vitB5 cho tế bào soma trắc đực sữa, nhìn dưới kính hiển vi thấy tế bào cĩ dạng hình cầu chuyển qua dạng tế bào phơi soma. Với mẫu nuơi cấy rễ ND, nghiệm thức A1 cho phát sinh tế bào soma thấp hơn nghiệm thức A2; nhưng khả năng tế bào soma chuyển trực tiếp qua phơi so ma cao. Phơi soma phát sinh trên mơi trư ờng nghiệm thức
A1 được sử dụng trong các nghiên cứu về sau
Nhân sinh khối dịch huyền phù phơi soma trên mơi trư ờng agar: Phơi soma phát
sinh từ rễ được đưa nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung BA, kinetin, NAA, IBA, 2.4D, vitB5. Kết quả nghiên cứu cho thấy tế bào tăng sinh nhanh trên nghi ệm thức B1.
Dưới kính hiển vi, các tế bào tiền phơi cĩ tế bào chất đậm đặc, khơng bào nhỏ, phân chia phát sinh phơi thứ cấp nhanh
Nhân sinh khối dịch huyền phù phơi soma trên mơi trường lỏng: Tế bào phơi soma
phát sinh từ nuơi cấy rễ, được đưa vào nuơi cấy trên mơi trường lỏng, với sinh khối ban
đầu nuơi cấy là 1g/65ml. Kết quả nghiên cứu cho thấy mật độ tăng sinh cao nhất là mơi
trường cơ bản MS cĩ bổ sung 2.4D hay bổ sung BA + Kin + IBA. Tuy nhiên, trên mơi
trường cĩ bổ sung 2.4D, tế b ào tăng sinh nhanh và cĩ khuynh hư ớng phản biệt hĩa
thành tế bào soma; ngược lại, trên mơi trường cĩ bổ sung BA + Kin + IBA tế bào phơi
soma đi vào quá trình phân chia và biệt hĩa
Trải dịch huyền phù phơi soma trên mơi trường agar: Dịch huyền phù tế bào phơi
soma trên nghiệm thức C5 được hút 10ml trải trên mơi trường nuơi cấy cĩ agar. Mơi trường nuơi cấy là MS cĩ bổ sung BA, 2.4D, NAA, IBA, Kin, vitB5. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 15 và 30 ngày nuơi cấy, nghiệm thức D1 và D2 cĩ độ tăng sinh khối cao so với nghiệm thức D3. So sánh giữa nghiệm thức D1 và D2, cho thấy trên nghiệm thức D1, phơi soma biệt hĩa mạnh mẽ chuyển từ màu trắng sữa sang màu vàng nhạt, bước chuyển qua tái sinh. Phơi soma trên nghiệm thức D1 được sử dụng trong nghiên cứu tái sinh
Tái sinh phơi soma: Tế bào phơi soma từ nghiệm thức D1 được sử dụng trong
nghiên cứu tái sinh. Với mơi tr ường nghiệm thức D1, tế bào phơi soma trải qua quá
trình phát triển hình cầu (sau 45 ngày), hình tim (sau 60 ngày), hình thủy lơi (sau 90
ngày) và tái sinh xuất hiện chồi đơn cĩ lá tiền sinh (sau 120 ngày)
Nhân nhanh cây dĩ bầu in vitro: Chồi đơn được đưa vào nhân nhanh trên mơi
trường WPM + BA (0,1mg/l) phát sinh cụm chồi. Cụm chồi nhân nhanh sau vài lần nuơi cấy truyền. Cụm chồi đ ược sử dụng làm protocol trong nhân nhanh in vitro.
KẾT LUẬN
Rễ cây dĩ bầu cấy mơ đ ược sử dụng trong nuơi cấy. Tế b ào phơi soma được nuơi
cây phát sinh trên mơi trư ờng MS + BA (7mg/l) + Ki (5mg/l) + IBA (0,5mg/l) +
vitaminB5 (10mg/l); nhân sinh khối tế bào phơi trên mơi trường bán rắn MS + BA (1mg/l) + Ki (1mg/l) + NAA (0,5mg/l) + vitaminB5 (5mg/l); nhân sinh khối trên mơi trường lỏng MS + BA (7mg/l) + Ki (5mg/l) + IBA (0,5mg/l); v à được trải trên mơi trường bán rắn MS + BA (1mg/l) + Ki (5mg/l) + NAA (0,5mg/l) + vitaminB5 (5mg/l). Tế bào phơi được nuơi cấy tái sinh sau 120 ng ày trên mơi trường WPM + BA (0,1mg/l). Chồi non từ phơi được tiếp tục vi nhân giống tr ên mơi trường WPM + BA (0,5mg/l). Lần đầu tiên tái sinh thành cơng tế bào phơi soma cây dĩ bầu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Khoa học và Cơng nghệ (2000). Sách Đỏ Việt Nam, phần Thực vật. NXB KH&KT, Hà Nội.
2. Lloyd G. & B. McCown (1980). Commercially feasible micropropagation of laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. Comb. Proc. Int. Plant Crop Soc. 30: 421-427
3. Murashige T. & R.Skoog (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:431-497
4. Pierik R. L. M. (1987). In vitro culture of higher plants . Martinus Nijhoff, Dordrecht, pp183-230
5. Thorpe T. A. (1980). Organogenesis in vitro: structural, physiological and biochemical aspects. Int. Rev. Cytol. Suppl. 11A: 71-112
SUMMARY