1.6. Nghiên cứu tính đa hình di truyền của ký sinh trùng sốt rét
1.6.1. Đa hình di truyền của P falciparum
1.6.1.1. Đặc điểm của locus gen mã hóa protein bề mặt của P. falciparum
Mối liên hệ giữa merozoite với màng hồng cầu liên quan tới một số protein bề mặt của ký sinh trùng. Các gen mã hóa cho các protein này có tính đa hình di truyền cao nh-: msp1 (merozoite surface protein 1 gene – msp1)
mã hóa cho protein bề mặt 1, msp2 (merozoite surface protein 2 gene –
msp2) mã hóa cho protein bề mặt 2 và glurp (glutatmate rich protein gene) mã
hóa cho protein giàu glutamat [62, 63]. Các locus gen này mang các đoạn trình tự lặp lại khác nhau. Các cá thể ký sinh trùng khác nhau thì có thể khác nhau về số l-ợng đoạn lặp lại (alen khác nhau).
Locus msp1 đ-ợc chia thành 17 đoạn [62, 139, 142]. Trong đó có 5
đoạn bảo thủ, 5 đoạn bán bảo thủ, 6 đoạn nhị hình và 1 đoạn lặp lại. Đoạn lặp lại nằm trong đoạn thứ 2 của locus msp1 (Hình 1.4).
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc locus msp1 của P. falciparum
(Theo Viriyakosol S. và cs (1995) [142]) Đoạn lặp lại Đoạn bảo thủ
Đoạn bán bảo thủ Đoạn nhị hình
Qua nghiên cứu tách dịng và giải trình tự các chủng ký sinh trùng nhiễm trên bệnh nhân thu từ thực địa, các nhà khoa học đã xác định có 3 kiểu gen khác nhau: Kiểu gen K1 (đ-ợc tách từ chủng ở Thái Lan), kiểu gen MAD20 (đ-ợc tách từ chủng ở Pa-pu-a Niu Ghi-nê) và kiểu gen RO33 (đ-ợc tách từ chủng ở Gha-na). Kiểu gen K1 chứa đoạn lặp lại 9 nucleotide có trình tự là AGTGCTCAA. Trong tự nhiên các ký sinh trùng thuộc kiểu gen K1 có thể chứa số l-ợng đoạn lặp lại khác nhau (các alen khác nhau). Kiểu gen MAD20 chứa đoạn lặp lại 9 nucleotide có trình tự là GGTTCAAGT. Trong tự nhiên kiểu gen MAD20 có nhiều alen khác nhau. Đoạn lặp lại 9 nucleotide
của kiểu gen RO33 có trình tự là CTGCAGATG. Kiểu gen RO33 rất hiếm gặp các alen khác nhau mà chỉ phát hiện thấy 1 alen có 9 đoạn lặp lại [105, 139].
Locus msp2 được chia thành 5 đoạn, trong đó đoạn 1 và 5 là đoạn bảo thủ, đoạn 2 và 4 là các đoạn nhị hình và đoạn 3 chứa các đoạn trình tự lặp lại. Sự khác nhau về số l-ợng đoạn lặp lại ở các KST khác nhau tạo nên tính đa hình (Hình 1.5).
Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc locus msp2 của P. falciparum
(Theo Viriyakosol S. và cs (1995) [142])
Các chủng KST thu đ-ợc từ thực địa đã đ-ợc tách dịng và giải trình tự cho thấy có 2 kiểu gen khác nhau là FC27 và IC1/3D7 (trong quần thể tự nhiên gọi chung là kiểu gen FC và IC). Kiểu gen FC27 (đ-ợc tách từ chủng tại Pa-pu-a Niu Ghi-nê) chứa 5 đoạn lặp lại với trình tự 36 nucleotide nh- sau: AATACTAATAGTGTAGGTGCAAATGCTCCAAATGCT. Trong tự nhiên,
Đoạn lặp lại Đoạn bảo thủ
kiểu gen FC có nhiều alen khác nhau. Kiểu gen IC1 (đ-ợc tách từ chủng ở khu vực Đông D-ơng (giống với kiểu gen 3D7 ở Nam Mỹ). Kiểu gen IC1 chứa 12 đoạn lặp lại với trình tự 12 nucleotide là: GGTGGTAGTGCT. Trong tự nhiên, kiểu gen IC có nhiều alen khác nhau [89, 142].
Locus glurp đ-ợc phân chia thành 3 đoạn: đoạn đầu R0 không chứa các đoạn lặp lại mã hóa kháng nguyên 100 axit amin, đoạn giữa RI mã hóa
kháng nguyên 100 - 200 axit amin và đoạn cuối RII chứa các đoạn lặp lại mã hóa kháng nguyên 70-100 axit amin [72, 142]. Đoạn lặp lại vùng RII
chứa 57 nucleotide. Trong tự nhiên locus glurp có nhiều alen khác nhau.
Ba locus gen msp1, msp2 và glurp nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau, là các gen có tính đa hình cao. Sử dụng kỹ thuật PCR với các đơi mồi đặc hiệu cho phép xác định đ-ợc kiểu gen của P. falciparum ở các mẫu máu của bệnh nhân SR và qua đó xác định đ-ợc tỷ lệ phân bố các kiểu gen, mức độ đa hình của từng kiểu gen, tỷ lệ nhiễm phối hợp kiểu gen và giá trị nhiễm đa alen (Multiplicity Of Infection - MOI) trong quần thể. Các chỉ số này mô tả cấu trúc di truyền của quần thể KST trong vùng dịch tễ sốt rét [81, 87, 96].
1.6.1.2. Một số kết quả nghiên cứu về tính đa hình di truyền của P. falciparum
Ferreira M.U. (1998), nghiên cứu so sánh mức độ đa hình ở locus msp1
của P. falciparum tại 3 vùng dịch tễ sốt rét khác nhau bao gồm vùng có mức độ lan truyền sốt rét thấp tại Tây Nam A-ma-dôn của Bra-xin, vùng lan truyền sốt rét cao tại Tan-da-ni-a của Châu Phi và vùng có mức độ lan truyền sốt rét trung bình là tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam. Kết quả đã xác định quần thể P. falciparum tại Bra-xin có 10 alen, 39% số mẫu nhiễm phối hợp kiểu gen, giá
trị MOI là 1,42; tại Tan-da-ni-a phát hiện đ-ợc 13 alen, 60% số mẫu nhiễm phối hợp kiểu gen, giá trị MOI là 2,37 và tại Việt Nam là 24 alen, 44% số mẫu nhiễm phối hợp kiểu gen, giá trị MOI là 1,76. Trong số 24 alen đ-ợc tìm thấy tại ba vùng có khoảng 90% tần suất xuất hiện của các alen nằm trong 7 alen
chung, nh-ng quần thể tại Việt Nam chỉ t-ơng đồng với khoảng 60% trong 7 alen này [91].
Nghiên cứu của Agnes Aubouy (2003) tại Ga-bơng, phân tích 52 mẫu máu lấy từ trẻ em nhiễm P. falciparum xác định đ-ợc 25 alen ở msp1 (14 K1, 8 MAD20 và 3 RO33) và 19 alen ở msp2 (11 FC và 8 IC). Tổng số có 50/52 mẫu đ-ợc xác định nhiễm phối hợp từ 2 kiểu gen trở lên với giá trị MOI trung bình của 2 locus là 4,0. Tuy nhiên, kết quả cho thấy khơng có mối t-ơng quan giữa mật độ KSTSR và độ tuổi với giá trị MOI [66].
Basco L. K. và cs (2004), nghiên cứu tính đa hình ở locus gen msp2 trên các mẫu bệnh nhân sốt rét tại Ca-mơ-run. Trong 137 mẫu phát hiện 53% mẫu nhiễm phối hợp cả 2 kiểu gen. Tỷ lệ kiểu gen FC chiếm 49,2% và kiểu gen IC chiếm 50,8%. Tổng số phát hiện đ-ợc 23 alen khác nhau [70].
Nghiên cứu tại Buốc-ki-na-Pha-xơ của Soulama I. (2009), phân tích 75 mẫu bệnh nhân sốt rét trên 2 locus msp1 và msp2 cho thấy kiểu gen K1 phổ
biến với tần suất xuất hiện >90%. Nhiễm phối hợp nhiều kiểu gen chiếm trên
90% số mẫu. Quần thể KST tại đây có sự đa hình rất cao. ở locus msp1 phát hiện 41 alen, locus msp2 phát hiện 29 alen. Giá trị MOI > 3,0 [134].
Joshi H. và cs (2006), nghiên cứu đa hình di truyền ở các phân lập P. faciparum thu thập tại 5 vùng có mức độ truyền nhiễm sốt rét khác nhau tại
ấn độ. Kết quả phân tích 130 mẫu bệnh nhân sốt rét ở 2 locus gen msp1 và msp2 cho thấy tại tất cả các điểm nghiên cứu có sự tồn tại của 3 kiểu gen K1,
MAD20, RO33 của msp1 và 2 kiểu gen FC và IC của msp2. Tại các vùng có
sự khác khác nhau về tỷ lệ xuất hiện của kiểu gen K1 từ 33,8% đến 72,7% và kiểu gen MAD20 có tỷ lệ từ 13,6% - 72,7% và kiểu gen RO33 chỉ phát hiện đ-ợc 1 alen có kích th-ớc 160 bp và tỷ lệ dao động từ 15% - 41,7%. Phát hiện có 15 alen ở locus msp2 (kiểu gen FC có 6 alen, tỷ lệ kiểu gen FC từ 18,2% đến 85%; kiểu gen IC có 9 alen, tỷ lệ kiểu gen IC từ 57,9% - 82,1%). Tỷ lệ
nhiễm phối hợp kiểu gen có sự khác nhau giữa các vùng từ 13,6% đến 83,3%. Giá trị MOI của msp1 từ 1,1 đến 2,1 và MOI của msp2 từ 1,0 đến 1,6 [104].
Ghanchi N.K. và cs (2009), nghiên cứu phân tích 2 locus gen msp1 và
msp2 của P. falciparum tại Pa-ki-xtan. ở locus msp1, phát hiện đ-ợc 25 alen
(12 K1, 8 MAD20 và 5 RO33), có 24% (56/231) số mẫu nhiễm phối hợp kiểu gen và ở locus msp2 có 33 alen (14 FC và 19 IC), có 22% (51/236) số mẫu
nhiễm phối hợp kiểu gen. Giá trị MOI là 1,25 ở locus msp1 và 1,22 ở locus msp2 [98].
Tại khu vực Đông Nam á, Snounou G. và cs [139] nghiên cứu tính đa hình di truyền ở locus msp1, msp2 và glurp trong quần thể P. falciparum tại
Thái Lan năm 1999. Phân tích tổng số 113 mẫu bệnh nhân sốt rét thu đ-ợc 76% các mẫu nhiễm phối hợp từ 2 kiểu gen trở lên, phát hiện 10 alen ở locus
msp1, 17 alen ở locus msp2 và 12 alen ở locus glurp.
Nghiên cứu của Khang J.M. và cs tại Mi-an-ma năm 2010, phân tích 63 mẫu nhiễm P. falciparum cho thấy tỷ lệ nhiễm phối hợp nhiều kiểu gen trên một bệnh nhân là rất cao (63,5% ở locus msp1 và 68,3% ở locus msp2), phát hiện 14 alen ở locus msp1 (5 alen của K1, 9 alen của MAD20), 22 alen ở
locus msp2 (7 alen của FC và 15 alen của IC). Tại nghiên cứu này tác giả
khơng phát hiện có kiểu gen RO33 [107].
Atroosh W.M. và cs nghiên cứu đa hình di truyền ở 2 locus msp1 và msp2 trên 65 mẫu nhiễm P. faciparum tại Ma-lai-xi-a cho thấy RO33 là kiểu
gen trội chiếm 80% (52/65) trong khi đó kiểu gen K1 có tần số xuất hiện thấp, 66,2% các mẫu là nhiễm một kiểu gen, 33,8% các mẫu nhiễm phối hợp từ 2 kiểu gen. Locus msp2 xác định đ-ợc 76% thuộc kiểu gen IC. Giá trị MOI là 1,37 ở locus msp1 và 1,20 ở locus msp2. Mức độ đa hình của P. falciparum rất thấp chỉ xác định đ-ợc 3 alen ở locus msp1 và 4 alen ở locus msp2 [65].
Nghiên cứu của Khaminsou N. và cs (2011) tại Lào trên 230 mẫu bệnh nhân. Locus msp1 xác định đ-ợc 26 alen (11 alen của K1, 8 alen của MAD20 và 7 alen RO33). Nhiễm đơn K1 chiếm 27,83%, MAD20 là 11,74% và RO33 là 5,22% còn lại là nhiễm phối hợp nhiều kiểu gen (45,65%). Giá trị MOI là 1,6 [109].
Irawati N. (2011), nghiên cứu tại In-đơ-nê-xi-a, phân tích 56 mẫu trên locus msp1 phát hiện đ-ợc 7 alen (3 K1, 2 MAD20 và 2 RO33). Tần suất xuất hiện của các kiểu gen K1 chiếm 36,84%, MAD20 34,21% và RO33 là 28,9% tại vùng núi. Tại điểm nghiên cứu ven biển K1 chiếm 44,8%, MAD20 là 37,93% và RO33 là 17,24% [103].
Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu đa hình di truyền quần thể P. falciparum tại Quảng Bình giai đoạn 2004-2005, phân tích 113 mẫu bệnh
nhân sốt rét ở locus msp1 thu đ-ợc 33 alen (17 K1, 15 MAD20 và 1 RO33).
Tần suất xuất hiện của K1 là 37,42%, MAD20 là 41,1% và RO33 là 21,48%.
ở locus msp2 phát hiện 26 alen, trong đó 16 alen IC với tỷ lệ kiểu gen IC là 76,57% và 10 alen FC với tỷ lệ kiểu gen là 32,43%. ở locus glurp xác định đ-ợc 13 alen. Giá trị MOI của msp1 > 1,3 (K1 là 1,34 và MAD20 là 1,37);
MOI của msp2 là 1,83 (IC 2,04 và FC 1,61) và glurp là 1,61 [12].
Tại tỉnh Bình Ph-ớc giai đoạn 2005-2009, kết quả phân tích 3 locus gen
msp1, msp2 và glurp ở 100 mẫu cho thấy: ở locus msp1, kiểu gen K1 chiếm
32,58%, MAD20 chiếm 45,04% và RO33 chiếm 22,36%. Tỷ lệ nhiễm phối
hợp kiểu gen rất cao chiếm 47% và giá trị MOI của msp1 là 1,56. ở locus
msp2 kiểu gen FC chiếm 44,56% và IC chiếm 55,44%, tỷ lệ nhiễm phối hợp 2
kiểu gen chiếm 42,5%, giá trị MOI là 1,43. ở locus glurp phát hiện 10 alen,
giá trị MOI là 1,19 [13].
Tại Ninh Thuận, kết quả phân tích 50 mẫu nhiễm P. falciparum phát
và 1 alen của RO33), 14 alen ở locus msp2 (5 alen của FC và 9 alen của IC), 6 alen ở locus glurp (với kích th-ớc sản phẩm tử 582 – 981bp). Giá trị MOI của K1 là 1,06, MAD20 là 1,00, FC là 1,08, IC là 1,24 và glurp là 1,24 [56].