2.3. VËt liƯu nghiªn cøu
2.3.2. Thiết bị và hóa chất tách chiết ADN
+Tđ l¹nh - 40C, -200C bảo quản mẫu và hãa chÊt
+ C¸c bé micropipet (h·ng Gilson – Pháp, Eppendorf - Đức)
+ Máy ly tâm tốc độ cao (Centrifuge 5415R - h·ng Eppendorf - §øc) + Tđ Êm (h·ng Menmert – Thỉ NhÜ Kú)
+ M¸y lắc, máy khuấy từ Rotolab (hÃng OSI, Pháp) + C©n phân tích kỹ thuật (hÃng Sartorius - Đức) + Mỏy đo pH (HM-16S của hÃng TOA, Nhật Bản)
+ èng Eppendorf 1,5 ml (h·ng Corning -Mü, Watson-NhËt)
+ Đầu típ 1ml, 200l, 20l vµ 10l (Corning, Thermoscientific -Mü) + PBS; Saponin; Chelex resin 100, Ethanol... (h·ng Sigma, Takara) + Bé kÝt t¸ch ADN (QIAamp DNA blood mini KIT - QIAGEN -Mü).
2.3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất để tiến hành phản ứng PCR
+ M¸y PCR (AB 9700 h·ng Applied Biosystems, Eppendorf Đức). + Các bé micropipet (h·ng Gilson – Pháp, Eppendorf-Đức)
+ Máy lắc Rotolab (hÃng OSI- Pháp)
+ Tube PCR 0,2ml (h·ng Corning, Thermoscientific- Mü)
+ Đầu típ 1ml, 200l, 20l vµ 10l (Corning, Thermoscientific -Mü) + C¸c cặp mồi để chẩn đốn, phân biệt 4 lồi KSTSR P. falciparum, P.
vivax, P. malariae, P. ovale.
+ C¸c cặp mồi xác định kiểu gen của P. falciparum ë locus msp1, msp2 vµ glurp.
+ Các cặp mồi xác định kiểu gen của P. vivax ở locus Pvcs và Pvmsp1. + Các cặp mồi xác định đột biến cđa P. falciparum kh¸ng víi mét sè
lo¹i thuèc sèt rÐt.
Các mồi đ-ợc đặt tổng hợp từ hÃng Geneworks - óc; Sigma, Invitrogen- Mü, Takara - Nhật. (Trình tự các cặp mồi đ-ợc trình bày ở phần sau) + dNTPs ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (h·ng Fermentas - §øc)
+ Taq DNA- polymerase (ViÖn Sèt rÐt - KST - CTTƯ sản xuất)
+ 10 X PCR buffers, MgCl2 25 mM (h·ng Fermentas - c) + Cỏc enzym giới hạn AluI và BstNI (h·ng Fermentas)
+ N-íc khư ion (ViƯn Sèt rÐt - KST - CTTƯ sản xuất bằng hệ thống EASYpure II- h·ng Thermoscientific- §øc)
+ Chứng d-ơng là các đơn dòng chuẩn nh-: K1, 3D7, D10, 7G8, W2, T96 (Ngn tõ ViƯn nghiªn cứu Y học nhiệt đới, Tr-ờng đại học Nagasaki, Nhật Bản và Khoa Y học nhiệt đới, Tr-ờng đại học Mahidol, Thái Lan)
2.3.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất cho điện di phân tích kết quả PCR
+ Lß vi sãng
+ Bộ điện di (Mulpid-one- Nht Bn, Apelex-Pháp) + Bộ micropipet (hÃng Gilson), đèn soi gel (®Ìn UV)
+ Hệ thống chụp và phân tích ảnh Bioimaging systems SDS – 8000 + M¸y in nhiƯt Mitsubishi, giÊy in nhiƯt (NhËt)
+ Dung dịch đệm ®iƯn di TBE (1X, 10X)- Invitrogen-Mü + Agarose (TopVisionTM LE GQ, h·ng Fermentas)
+ Dung dịch ethidium bromide 10mg/ml (hÃng Sigma)
+ Các loại thang đo kích th-ớc ph©n tư ADN nh-: GenrulerTM100bp, 1kb, 50bp DNA ladder, Marker BR322 DNA/BsuRI, phiX174 DNA/BsuRI (HaeIII) Marker (h·ng Fermentas)
2.4. Ph-ơng pháp nghiên cứu
2.4.1. ThiÕt kÕ nghiªn cứu
Nghiên cứu mơ tả và phân tích
2.4.2. Mẫu nghiên cứu
2.4.2.1. Ph-ơng pháp thu thËp mÉu
- Tiến hành điều tra thu thập lam máu và mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3 MM ë ng-êi d©n sèng trong vùng sốt rét l-u hành tại 7 xà thuộc 3 hun LƯ Thđy tØnh Quảng Bình, H-ớng Hóa tỉnh Quảng Trị và huyện A L-íi tØnh Thõa Thiên Huế. Lam máu và mẫu máu trên giấy thấm ®-ỵc thu thËp bằng cách lấy máu đầu ngón tay để làm tiêu bản lam máu, đồng thời lấy 30- 50 l máu nhỏ lên giấy Whatman3MM.
- Sư dơng kü tht xÐt nghiƯm lam m¸u nhuém giemsa theo kü thuËt th-êng quy cđa ViƯn Sèt rÐt - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung -ơng [55] để phát hiện và định loại KSTSR, bệnh nhân có KSTSR đ-ợc điều trị thuốc sốt rét theo phác đồ h-ớng dẫn điều trị của Bộ Y tế [2].
- MÉu m¸u trên giấy thấm đ-ợc để khô tự nhiên. Mỗi mẫu máu bảo quản riªng biƯt trong tói nylon. Do điều kiện khó khăn ở thực địa và do những chuyến đi dài ngày vào vùng sâu, vùng xa nên chúng tôi chú ý:
a/ Để tách rời riêng từng mẫu trong túi nylon tránh tạp nhiễm chéo.
b/ Điều kiện thực địa máu lâu khô, việc bảo quản mẫu địi hỏi để khơ hoàn toàn nhằm tránh đ-ợc vi khuẩn và nấm mốc phát triển. Khi để khô tự nhiên ở điều kiện thực địa phải tránh các loại côn trùng đến ăn (ruồi, muỗi, kiến ).
2.4.2.2. Ph-ơng pháp chọn mẫu
Chän mÉu nghiªn cøu cã chđ ®Ých
- Chän mẫu để phân tích thành phần, cơ cấu lồi theo kü thuËt PCR gåm: + 210 mÉu cã KSTSR theo kÕt qu¶ xÐt nghiƯm lam m¸u nhuém giemsa ë 3
tỉnh đ-ợc phân tích định loại lồi bằng kỹ thuật PCR lång.
+ Ph©n tÝch 1.174 mÉu ©m tÝnh theo kÕt qu¶ xÐt nghiƯm lam m¸u nhuém giemsa thu ë tØnh Thõa Thiªn HuÕ b»ng kü thuËt PCR.
- Chän mÉu ®Ĩ phân tích kiểu gen, xác định tính đa hình của KSTSR gåm c¸c mÉu bnh nhân nhim P. falciparum và P. vivax (ë c¶ mÉu nhiễm
đơn và nhiễm phối hợp) đ-ợc lựa chọn. Cụ thể nh- sau:
+ 162 mÉu bƯnh nh©n nhiƠm P. falciparum đ-ợc sử dụng để phân tích tính đa hình di truyền của quần thĨ P. falciparum.
+ 85 mÉu bƯnh nh©n nhiƠm P. vivax đ-ợc sử dụng để phân tích tính đa hình di trun cđa qn thĨ P. vivax.
- Lùa chän mÉu ph©n tích đột biến kháng thuốc: 162 mÉu bƯnh nh©n nhiƠm P. falciparum đ-ợc sử dụng để phân tích đột biến điểm liên quan đến tính kháng một số loại thuốc sốt rÐt.
2.4.3. C¸c kü tht sư dơng trong nghiên cứu
2.4.3.1. Kỹ tht xét nghim lam máu nhm giemsa
Lấy máu đầu ngón tay làm tiêu bản giọt dày. Nhuộm tiêu bản b»ng dung dÞch giemsa, soi và định loại KSTSR theo qui trình kỹ thuật của ViƯn Sèt rÐt - KST - CTTƯ [55].
2.4.3.2. Kỹ thuật tách ADN
Có nhiều ph-ơng pháp tách, tinh khiÕt ADN cña KSTSR tõ giÊy thÊm Whatman 3MM. Trong đề tài này, chúng tôi chọn 2 ph-ơng ph¸p t¸ch, tinh khiÕt ADN cho 2 loại mẫu gồm:
- Tách ADN các mẫu thu thập từ ng-ời dân sống trong vùng sốt rét:
Tách ADN từ mẫu máu trên giÊy thÊm Whatman 3MM b»ng ph-ơng pháp sử dụng Chelex 100 theo Kain và Lannar năm 1991 và Plowe CV vµ cs 1995 [106, 125]. Qui trình tách chiết ADN đ-ợc tóm tắt nh- sau:
B-íc 1: đ mÉu giấy thấm có chứa máu bệnh nhân đà cắt nhỏ víi 1ml dung dÞch saponin 0,5% ở nhit độ 370C trong 30 phút. Li tâm 12.000 vßng/phót trong 10 phót, loại bỏ dịch nổi.
B-ớc 2: Rửa 3 lần, mỗi lần với 1ml dung dịch ®Ưm PBS pH 7,4
B-íc 3: Loại bỏ hết dịch nổi và thêm vào mỗi èng 100l dung dÞch Chelex 10%, đun sôi trong thời gian 10 phót, Li t©m thu dịch nổi ADN và bảo quản ở nhiệt độ -200C cho đến khi đ-a vào phản ứng PCR.
- T¸ch ADN c¸c mÉu m¸u đà xác định có KSTSR bằng soi kính hiển vi:
C¸c mÉu cã KSTSR theo kÕt qu¶ xÐt nghiƯm lam m¸u nhuém giemsa đ-ợc tách và tinh sạch ADN bằng bộ kít QIAamp DNA blood mini. Qui tr×nh tách ADN theo h-ớng dẫn của nhà sản xuất (H·ng QIAGEN).
2.4.3.3. Kü thuật PCR lồng chẩn đốn, phân biệt bốn lồi KSTSR
¸p dơng kü thuËt PCR lồng và trình tự mồi theo Snounou G. vµ cs (1993) [136] để chẩn đốn, phân biệt 4 loài KSTSR trên ng-ời.
- Phản ứng PCR để nhân bản đoạn gen đặc hiệu cho giống Plasmodium (gäi lµ Nest 1). CỈp måi sư dơng cho Nest 1 ký hiƯu lµ PLU5 và PLU6 có trình tự nh- sau:
PLU5: 5'-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC-3' PLU6: 5'-TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG-3'
+ Thành phần phản ứng Nest 1 với tổng thể tích 25 l nh- sau: 10 x PCR buffer (15 mM MgCl2) 2,5 l
dNTPs (2,0 mM) 2,5 l PLU5 (1,25 M) 1,0 l PLU6 (1,25 M) 1,0 l
Taq DNA polymerase (1 đơn vị) 1,0 l DÞch chiÕt ADN 3,0 l H2O 14,0 l
+ Chu trình nhiệt của phản ứng Nest 1 nh- sau: 950C - 5 phót, tiÕp theo 25 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 580C- 2 phót, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối lµ 720C - 8 phót.
- Phản ứng Nest 2 để nhân bản gen đặc hiƯu cho tõng loµi KSTSR. Sư dụng các cặp mồi FAL1 và FAL2, VIV1 vµ VIV2, MAL1 vµ MAL2, OVA1 và OVA2. Trình tự các cặp mồi nh- sau:
FAL1: 5'- TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT -3' FAL2: 5'-ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3' VIV1: 5'-CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC-3' VIV2: 5'-ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA-3' MAL1: 5'-ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC-3' MAL2: 5'-AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA-3' OVA1: 5'-ATC TCT TTT GCT ATT TTT TAG TAT TGG AGA-3' OVA2: 5'-GGA AAA GGA CAC ATT AAT TGT ATC CTA GTG-3'
+ Thành phần phản ứng Nest 2 nh- Nest 1, chỉ khác là lấy 01l ADN khuôn từ sản phẩm Nest 1 và các cặp mồi t-ơng ứng cho 4 loµi KSTSR.
+ Chu trình nhiệt của phản ứng Nest 2 nh- Nest 1 nh-ng đ-ợc tiến hành trong 30 chu kỳ. Sơ đồ kỹ thuật PCR lồng chẩn đốn, phân biệt 4 lồi KSTSR trong máu ng-ời đ-ợc mơ tả ở Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ kỹ thuật PCR lồng chẩn đốn, phân biệt 4 lồi KSTSR
2.4.3.4. Kü thuËt PCR xác định đa hình di truyền kiểu gen của P. falciparum
¸p dông kü thuËt PCR và trình tự mồi theo Snounou G. vµ cs (1999) [139] để xác định kiĨu gen cđa P. falciparum dùa trªn ba locus msp1, msp2 vµ
glurp.
- Phản ứng Nest 1 sử dụng các đơi mồi có tr×nh tù nh- sau:
M1-OF: 5'- CTA GAA GCT TTA GAA GAT GCA GTA TTG -3' M1-OR: 5'- CTT AAA TAG TAT TCT AAT TCA AGT GGA TCA -3'
Plasmodium đặc hiệu
Sơ đồ ph¶n øng PCR lång – nhân bản đặc hiệu gen
18S rARN để xác định 4 loài KSTSR
M2-OF: 5'- ATG AGG GTA ATT AAA ACA TTG TCT ATT ATA -3' M2-OR: 5'- CTT TGT TAC CAT CGG TAC ATT CTT -3'
G-OF: 5'- TGA ATT TGA AGA TGT TCA CAC TGA AC -3' G-OR: 5'- GTG GAA TTG CTT TTT CTT CAA CAC TAA -3'
Chu tr×nh nhiƯt cđa Nest 1 lµ: 950C - 5 phót, tiÕp theo 25 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 580C- 2 phót, 720C - 2 phót, tỉng hỵp lần cuối là 720C - 8 phót. - Phản ứng Nest 2 sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tại Bảng 2.1 để xác định kiĨu gen cđa P. falciparum.
Chu tr×nh nhiƯt cđa phản ứng Nest 2 là: 950C - 5 phót, tiÕp theo 30 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 640C- 2 phót, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút đối với các locus msp1, msp2 vµ 950C - 5 phót, tiÕp theo 30 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 580C- 2 phót, 720C - 2 phót, tổng hợp lần cuối l 720C - 8 phút đối với locus glurp.
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi nhân bản các kiểu gen cđa P. falciparum
KiĨu gen Måi Tr×nh tù
K1 M1-2KF M1-2KR
5'- AAA TGA AGA AGA AAT TAC TAC AAA AGG TGC -3' 5'- GCT TGC ATC AGC TGG AGG GCT TGC ACC AGA -3'
MAD20 M1-2MF M1-2MR
5'- AAA TGA AGG AAC AAG TGG AAC GAC TGT TAC -3' 5'- ATC TGA AGG ATT TGT ACG TCT TGA ATT ACC -3'
RO33 M1-2RF M1-2RR
5'- TAA AGG ATG GAG CAA ATA CTC AAG TTG TTG -3' 5'- CAT CTG AAG GAT TTG CAG CAC CTG GCG ATC -3'
FC M2-FCF M2-FCR
5' - AAT ACT AAG AGT GTA GGT GCA AAT GCT CCA-3' 5' - TTT TAT TTG GTG CAT TGC CAG AAC TTG AAC-3'
IC M2-ICF M2-ICR
5'- AGA AGT ATG GCA GAA AGT AAG CCT CCT ACT-3' 5'- GAT TGT AAT TCG GGG GAT TCA GTT TGT TCG-3'
Glurp G-FN
G-OR
5'- TGT TCA CAC TGA ACA ATT AGA TTT AGA TCA -3' 5'- GTG GAA TTG CTT TTT CTT CAA CAC TAA -3'
Kü thuật PCR xác định kiểu gen cña P. falciparum theo locus msp1, msp2 vµ glurp đ-ợc mơ tả tóm tắt ở H×nh 2.2.
H×nh 2.2. Sơ đồ kỹ thuật PCR xác định kiểu gen của P. falciparum
2.4.3.5. Kỹ thuật PCR xác định đa h×nh di trun kiĨu gen cđa P. vivax
¸p dụng kỹ thuật PCR và trình tự mồi theo Imwong M. và cs 2005 [102] để ph©n tÝch kiĨu gen cđa P. vivax dựa trên locus Pvcs và Pvmsp1.
* K thut PCR lồng xác định kiểu gen của P. vivax theo locus Pvcs:
- Phản ứng Nest 1 sử dụng cặp mồi có trình tự là:
VCS-OF: 5’- ATGTAGATCTGTCCAAGGCCATAAA-3’
VCS-OR: 5’-TAATTGAATAATGCTAGGACTAACAATATG-3’ Chu trình nhiệt của Nest 1 là: 950C - 5 phót, tiÕp theo 25 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 580C- 2 phót, 720C - 2 phút, tổng hợp lần ci lµ 720C - 8 phót. - Phản ứng Nest 2 nhân bản kiểu gen Pvcs đặc hiệu, sử dụng cặp mồi có trình tù lµ:
VCS-NF: 5’-GCAGAACCAAAAAATCCACGTGAAAATAAG-3’ VCS-NR: 5- CCAACGGTAGCTCTAACTTTATCTAGGTAT-3
Chu trình nhit ca Nest 2 là: 950C - 5 phót, tiÕp theo 30 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 620C- 2 phót, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phót. Locus glurp alen Locus msp2 IC FC Locus msp1 K1 MAD20 RO33
Kỹ thuật PCR đa mồi nhõn bn các locus gen
msp1, msp2 và glurp (Nest 1)
Kỹ thuật PCR xác định các kiÓu gen ë locus msp1, msp2 vµ glurp sử dụng các cặp mồi đặc hiệu (Nest 2)
- Để xác định kiểu gen cña P. vivax theo locus Pvcs, sau khi thu đ-ợc sản
phÈm PCR tõ ph¶n øng Nest 2 thì sử dụng enzym giới hạn AluI c¾t sản phẩm PCR để xác định kiểu gen VK210 và enzym giới hạn BstNI c¾t sản phẩm PCR xác định kiÓu gen VK247.
+ Thành phần tham gia phản ứng trong tổng thể tích 15 l nh- sau: S¶n phÈm PCR cña Nest 2: 5 l
Enzym AluI (10 đơn vị): 0,5 l 1X Tango buffers: 1,0 l N-íc cÊt khư ion: 8,5 l + ñ mÉu ë nhiƯt ®é 370C trong 16 giê
+ Thành phần và điều kiện ph¶n øng khi sư dơng enzym BstNI cng
t-ơng tự nh- trên, s dng buffers theo h-ớng dÉn cđa nhà sản xuất.
* Kỹ thuật PCR lồng xác định kiểu gen của P. vivax theo locus Pvmsp1:
Ba đoạn F1, F2 vµ F3 cđa locus Pvmsp1 đ-ợc s dng đ phân tích tính đa hình cđa P. vivax. Trong ®ã trình tự mồi và chu trình nhiệt của các đoạn
nh- sau:
Ph©n tích đoạn F1:
- Ph¶n øng Nest 1 sư dụng cặp mồi có trình tự là:
VM1-O1R: 5’- CCACTCCATGAAACTGAAGTGTTTA-3’
VM1-N1F: 5’- CGATATTGGAAAATTGGAGACCTTCATCAC-3’ Chu trình nhiệt của Nest 1 là: 950C - 5 phót, tiÕp theo 25 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 640C- 2 phót, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phót. - Phản ứng Nest 2 sử dụng cặp mồi có trình tù là:
VM1-N1F: 5- CGATATTGGAAAATTGGAGACCTTCATCAC-3 VM1-N1R: 5 CTTTTGCGCCTCCTCCAGCTGGCTCGTGT - 3 Chu trình nhiƯt cđa Nest 2 lµ: 950C - 5 phót, tiÕp theo 30 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 640C- 2 phót, 720C - 2 phót, tỉng hợp lần cuối là 720C - 8 phót.
Phân tích đoạn F2:
- Phản ứng Nest 1 sử dụng cặp mồi có trình tự là:
VM1-O2F: 5’– GATGGAAAGCAACCGAAGAAGGGAAT-3’ VM1-O2R: 5’ – AGCTTGTACTTTCCATAGTGGTCCAG-3’
Chu trình nhit ca Nest 1 là: 950C - 5 phút, tiÕp theo 25 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 600C- 2 phót, 720C - 2 phót, tỉng hỵp lần cuối là 720C - 8 phót. - Phản ứng Nest 2 sử dụng cặp mồi có trình tự là:
VM1-O2R: 5’ – AGCTTGTACTTTCCATAGTGGTCCAG-3’
VM1-N2F: 5’ – AAAATCGAGAGCATGATCGCCACTGAGAAG-3’ Chu tr×nh nhiƯt cđa Nest 2 lµ: 950C - 5 phót, tiÕp theo 30 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 660C- 2 phót, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phót.
Phân tích đoạn F3:
Trình tự mồi cho nhân bản vùng F3 của locus Pvmsp1: VM1-3F: 5’– CAAGCCTACCAAGAATTGATCCCCAA-3’ VM1-3R: 5’ – ATTACTTGTCGTAGTCCTCGGCGTAGTCC-3’
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân bản đoạn F3 là: 950C - 5 phót, tiÕp theo 35 chu kú gåm: 940C - 1 phót, 660C- 2 phót, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối lµ 720C - 8 phót.
2.4.3.6. Kỹ thuật PCR xác định P. falciparum kháng thuốc pyrimethamin
¸p dông kü thuËt PCR 3 lần và trình tự các đôi mồi theo Masimirembwa C. M. vµ cs (1999) [114]. Hai ph¶n ứng đầu nhằm tăng số l-ợng ADN khuôn. Phản ứng PCR lần 3 là phản ứng đặc hiệu xác định kiểu gen nhạy, kiểu đột biÕn.
- Ph¶n øng Nest 1 sử dụng cặp mồi có trình tự lµ: