3.1. Thành phần, cơ cấu lồi KSTSR tại các tỉnh Quảng Bình, Quảng
3.1.2. Kết quả xác định thành phần, cơ cấu loài KSTSR bằng
Thành phần, cơ cấu loài KSTSR tại 3 tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn đ-ợc xác định dựa trên kết quả phân tích định loại KSTSR bằng kỹ thuật PCR ở 208 mẫu máu bệnh nhân nhiễm KSTSR của 2 tỉnh Quảng Bình và Quảng Trị (Bảng 3.1) và tổng số 1.176 mẫu máu thu thập ở ng-ời dân sống trong vùng sốt rét l-u hành tại tỉnh Thừa Thiên Huế (02 mẫu có KSTSR và 1.174 mẫu âm tính). Kết quả phân tích bằng kỹ thuật PCR thu đ-ợc nh- sau:
Tại tỉnh Quảng Bình, phân tích 96 mẫu có KSTSR đã xác định có mặt của 3 lồi KSTSR là P. falciparum, P. vivax và P. malariae. Số mẫu bệnh
nhân nhiễm đơn là 75 mẫu chiếm tỷ lệ 78,13% trong đó nhiễm đơn P. falciparum là 48,96%, nhiễm đơn P. vivax là 29,17%. Số mẫu bệnh nhân
nhiễm phối hợp 2 và 3 loài là 21/96 mẫu chiếm tỷ lệ 21,87% trong đó nhiễm phối hợp 2 loài là 20 mẫu chiếm tỷ lệ 20,83% và nhiễm phối hợp 3 loài là 01 mẫu chiếm tỷ lệ 1,04%.
Tại tỉnh Quảng Trị, phân tích 112 mẫu có KSTSR đã xác định có mặt 2 loài KSTSR là P. falciparum và P. vivax. Số bệnh nhân nhiễm đơn là 94 mẫu chiếm tỉ lệ 83,93% trong đó nhiễm đơn P. falciparum là 56,25%, nhiễm đơn
P. vivax là 27,68%. Số mẫu bệnh nhân nhiễm phối hợp 2 loài là 18 mẫu chiếm tỷ lệ 16,07%.
Tại tỉnh Thừa Thiên Huế, phân tích 1.176 mẫu máu của ng-ời dân sống trong vùng sốt rét l-u hành, đã phát hiện đ-ợc 23 mẫu máu có KSTSR, tỷ lệ bệnh nhân nhiễm KSTSR phát hiện đ-ợc bằng kỹ thuật PCR là 1,96%. Số mẫu bệnh nhân nhiễm đơn là 21 mẫu chiếm tỷ lệ 91,30% trong đó có 14 mẫu nhiễm đơn P. falciparum chiếm tỷ lệ 60,87%, có 07 mẫu nhiễm đơn P. vivax
chiếm tỷ lệ 30,43% và 02 mẫu bệnh nhân nhiễm phối hợp P. falciparum và P.
vivax chiếm tỷ lệ 8,70%.
Kết quả phân tích tỷ lệ bệnh nhân nhiễm đơn, nhiễm phối hợp loài KSTSR tại 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế đ-ợc trình bày tại Bảng 3.4, Phụ lục 1.
Bảng 3.4. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm đơn, nhiễm phối hợp loài KSTSR
theo kỹ thuật PCR
Địa điểm
Nhiễm đơn Nhiễm phối hợp
Số l-ợng mẫu P. f P. v P. f , P. v; P. f , P. m P. f , P. v và P. m n % n % n % n % Quảng Bình 47 48,96 28 29,17 20 20,83 01 1,04 96 Quảng Trị 63 56,25 31 27,68 18 16,07 0 0 112 Thừa Thiên Huế 14 60,87 7 30,43 2 8,07 0 0 23
Tổng 124 53,68 66 28,57 40 17,32 01 0,43 231
Ghi chú: P. f: P. falciparum; P. v: P. vivax và P. m: P. malariae
P. f , P. v; P. f , P. m: nhiễm phối hợp 2 loài và P. f , P. v và P. m: nhiễm phối hợp 3 loài Tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn chúng tôi không phát hiện đ-ợc tr-ờng hợp bệnh nhân nào nhiễm loài P. ovale bằng cả 2 kỹ thuật chẩn đoán. Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số mẫu nhiễm đơn, nhiễm phối hợp 2, 3 lồi đ-ợc thể hiện ở Hình 3.1 và 3.2.
L F V M O F V M O F V M O F V M O
Hình 3.1. ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu bệnh nhân nhiễm đơn
P. falciparum và P. vivax
L: Thang chuẩn 50bp K1: chứng dương cho P. falciparum
Neg. : chứng âm (máu ng-ời khơng có KSTSR)
B5, B8: các mẫu bệnh nhân nhiễm đơn P. falciparum và P. vivax
Hình 3.2. ảnh điện di sản phẩm PCR các mẫu bệnh nhân nhiễm
phối hợp 2, 3 loài KSTSR
L: Thang chuẩn 50bp P: chứng dương cho P. f, P. v, P. m và P. o
N: chứng âm (máu ng-ời khơng có KSTSR)
B56: mẫu bệnh nhân nhiễm phối hợp P. falciparum và P. vivax
B58: mẫu bệnh nhân nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax và P. malariae
Bằng kỹ thuật PCR đã xác định đ-ợc tổng số 231 bệnh nhân có KSTSR ở 3 tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn. Trong đó có 190 bệnh nhân nhiễm
L F V M O F V M O F V M O F V M O P N B56 B58 200 bp 800 bp 500 bp 100 bp
đơn chiếm tỷ lệ 82,25%, nhiễm phối hợp 2 và 3 loài KSTSR là 41 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 17,75%. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm phối hợp các loài KSTSR phát hiện đ-ợc bằng kỹ thuật PCR có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) so với kết quả xác định bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa (Bảng 3.5 và Hình 3.3).
Bảng 3.5. So sánh tỷ lệ bệnh nhân nhiễm đơn và nhiễm phối hợp ở khu vực
Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam
Kiểu nhiễm Kỹ thuật
Nhiễm đơn Nhiễm phối hợp
n % n % Giemsa (n= 210) 198 94,29 12 5,71 PCR (n=231) 190 82,25 41 17,75 p 0,0001 94,29 82,25 5,71 17,75 0 20 40 60 80 100 T ỷ l ệ %
Nhiễm đơn Nhiễm phối hợp
Kiểu nhiễm trên bệnh nhân
Giemsa Kỹ thuật PCR
Hình 3.3. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm đơn và nhiễm phối hợp theo kỹ thuật xét
nghiệm lam máu nhuộm giemsa và PCR
Trong giai đoạn sốt rét diễn ra nghiêm trọng ở n-ớc ta tr-ớc đây, nhiều nghiên cứu đã phát hiện đ-ợc tỷ lệ nhiễm phối hợp nhiều loài KSTSR trên bệnh nhân bằng kỹ thuật PCR là rất cao nh- tại Khánh Hòa (năm 1996) là
81% [9], Lâm Đồng (năm 1998) là 41%, Đắc Lắc (năm 2000) là 36,5% [10], Quảng Bình (năm 2005) là 30% [12], Gia Lai (2002) là 54,77% [38]. Kết quả phát hiện tỷ lệ nhiễm phối hợp các loài KSTSR ở khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam là 17,75% thấp hơn so với ở các tỉnh trên nh-ng không khác biệt lớn với kết quả điều tra gần đây ở một số tỉnh nh- Ninh Thuận là 22,60% [56], Bình Ph-ớc là 25,66% [38]. Kết quả này t-ơng đồng với của một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy tỷ lệ nhiễm phối hợp cao từ 80% đến 100% phát hiện đ-ợc ở những vùng lan truyền sốt rét cao [136] nh-ng thấp hơn nhiều tại một số n-ớc có lan truyền sốt rét trung bình nh- Y-ê-men, I-ran [60, 117].
Tần suất xuất hiện của 3 loài KSTSR trong 231 mẫu bệnh nhân nhiễm đơn và nhiễm phối hợp đ-ợc xác định bằng kỹ thuật PCR là 273 lần. Trong đó
P. falciparum chiếm tỷ lệ lớn nhất là 60,44% (165/273), P. vivax chiếm tỷ lệ
38,83% (106/273) và P. malariae phát hiện đ-ợc với tỷ lệ rất thấp là 0,73%
(02/273), không phát hiện đ-ợc tr-ờng hợp nhiễm P. ovale nào (Hình 3.4).
38,83%
60,44% 0,73%
P. falciparum P. vivax P. malariae
Hình 3.4. Biểu đồ cơ cấu loài KSTSR ở khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam
So với kết quả phát hiện bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa thì kỹ thuật PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu cao nên cho kết quả chính xác hơn về thành phần và cơ cấu loài ở 3 tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn.
Kỹ thuật PCR đã phát hiện thêm sự có mặt của lồi P. malariae với tỷ lệ
0,73%. Cơ cấu lồi KSTSR theo kết quả của kỹ thuật PCR có sự thay đổi so với kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa. Tuy vậy sự khác biệt này ch-a có ý nghĩa thống kê (p > 0,1) (Bảng 3.6).
Bảng 3.6. Cơ cấu loài KSTSR tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn theo kỹ thuật xét
nghiệm lam máu nhuộm giemsa và PCR
Loài KSTSR PCR Giemsa Số l-ợng Tỷ lệ (%) Số l-ợng Tỷ lệ (%) P. falciparum 165 60,44 150 67,57 P. vivax 106 38,83 72 32,43 P. malariae 2 0,73 0 0 P. ovale 0 0 0 0 Cộng 273 100 222 100
Hồi cứu các kết quả nghiên cứu xác định thành phần, cơ cấu loài bằng kỹ thuật PCR giai đoạn tr-ớc tại Quảng Bình, Quảng Trị cho thấy tại khu vực
này ch-a phát hiện đ-ợc tr-ờng hợp bệnh nhân nhiễm P. ovale. ở các tỉnh khác nh- Lâm Đồng, Bình Ph-ớc, Đắc Lắc và Gia Lai đều phát hiện có các bệnh nhân nhiễm P. ovale với tỷ lệ khoảng 2%, tỷ lệ P. malariae chung của cả 3 tỉnh Lâm Đồng, Bình Ph-ớc, Đắc Lắc là 5,3% và ở tỉnh Gia Lai là 13,92% [10, 12, 38]. Kết quả nghiên cứu ở khu vực Bắc Tr-ờng Sơn của chúng tôi tiếp tục khẳng định ở khu vực này có mặt 3 lồi KSTSR là P. falciparum, P. vivax và P. malariae.
Kết quả phân tích 1.176 mẫu máu ở ng-ời dân sống trong vùng sốt rét l-u hành tại tỉnh Thừa Thiên Huế bằng kỹ thuật PCR xác định đ-ợc tỷ lệ bệnh nhân cao hơn nhiều so với kỹ thuật nhuộm giemsa. Kỹ thuật PCR rất có giá trị trong các nghiên cứu về dịch tễ học đặc biệt là ở những vùng mà ng-ời dân
nhiễm KSTSR với mật độ thấp. Kết quả này cũng phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu khác ở vùng lan truyền sốt rét thấp trên thế giới [118, 132].
Bốn loài KSTSR gây bệnh sốt rét ở ng-ời mang nhiều đặc điểm khác nhau về biểu hiện lâm sàng, cách lan truyền cũng nh- đáp ứng của chúng đối với thuốc sốt rét nên việc chẩn đốn chính xác lồi gây bệnh có thể hạn chế việc điều trị không đầy đủ, làm giảm áp lực thuốc đối với KST và do đó có thể làm giảm KSTSR kháng thuốc. Nghiên cứu gần đây về bệnh học sốt rét [135] đã chỉ ra rằng mật độ KST nhiễm, sự nhiễm phối hợp nhiều loài KSTSR ở bệnh nhân có sự khác biệt so với bệnh nhân nhiễm đơn cùng loài. ở điều kiện tự nhiên tại những vùng có sự lan truyền sốt rét cao, có sự đa dạng về thành phần lồi thì quần thể KST truyền nhiễm trong một bệnh nhân là rất phức tạp.
Cho đến nay, sử dụng kỹ thuật PCR th-ờng qui trong chẩn đoán và quản lý bệnh nhân trên diện rộng cịn nhiều khó khăn. Tuy nhiên, sử dụng kỹ thuật PCR trong các điều tra dịch tễ học, giám sát hiệu lực điều trị của thuốc và đánh giá hiệu quả của các biện pháp can thiệt là hết sức cần thiết nhằm đánh giá đúng tình hình lan truyền sốt rét ở n-ớc ta.
Sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích thành phần, cơ cấu lồi KSTSR tại 3 tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam đã khẳng định tại đây có mặt 3 loài KSTSR là P. falciparum, P. vivax và P. malariae. Trong đó P. faciparum chiếm tỷ lệ là 60,44%, P. vivax chiếm tỷ lệ 38,83% và P. malariae phát hiện đ-ợc với tỷ lệ rất thấp là 0,73%. Mặt khác, kết quả phân tích cũng cho thấy tỷ lệ bệnh nhân nhiễm đơn và nhiễm phối hợp chỉ thể hiện chủ yếu ở 2 loài P. falciparum và P. vivax với tỷ lệ cao. Do vậy, chúng tôi chỉ tiến hành nghiên
cứu tính đa hình di truyền của 2 loài KSTSR là P. falciparum và P. vivax.
3.2. Tính đa hình di truyền của quần thể P. falciparum tại khu vực Bắc
Trong tổng số 231 mẫu bệnh nhân nhiễm KSTSR ở 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn Việt Nam, chúng tơi tiến hành phân tích kiểu gen để đánh giá tính đa hình của quần thể trên 162 mẫu nhiễm KSTSR P. falciparum. Kiểu gen của P. falciparum đ-ợc phân tích theo 3 locus msp1, msp2 và glurp.