Cơ chế tác động của chloroquin trong lysosome của KST

1.7.5. Đột biến gen ở P. falciparum liên quan đến kháng thuốc sốt rét

1.7.5.1. Cơ chế kháng thuốc của P. falciparum đối với pyrimethamin

Nghiên cứu thực nghiệm về KST kháng thuốc đ-ợc nghiên cứu trên P. yoelii, P. chabaudi, P. gallinaceum cho thấy tính kháng thuốc của KST đối

với pyrimethamin có cơ sở di truyền [144, 147]. Kết quả nghiên cứu giải trình tự gen dhfr ở các đơn dịng kháng cho thấy có sự thay đổi axit amin liên quan đến P. falciparum kháng pyrimethamin [61, 77, 133]. Đến nay, cơ chế kháng thuốc của P. falciparum đối với pyrimethamin đã đ-ợc khẳng định là có mối liên quan chặt chẽ với đột biến điểm ở vị trí 51, 59, 108, 164 trên gen dhfr

(dihydrofolate reductase gene) của P. falciparum kháng pyrimethamin [61, 112, 125, 141]. Bảng 1.6 trình bày tổng hợp các vị trí đột biến điểm trên gen

dhfr.

Bảng 1.6. Đột biến điểm trên gen dhfr của P. falciparum liên quan đến kháng

pyrimethamin

Sự thay đổi axit amin một số vị trí do đột biến trên gen dhfr

Vị trí Kiểu dại Kiểu đột biến

51 Asparagin (Asn) Isoleucin (Ile)

59 Cystein (Cys) Arginin (Arg)

108 Serin (Ser) Asparagin (Asn)

164 Isoleucin (Ile) Leucin (Leu)

Các kết quả nghiên cứu đánh giá mối t-ơng quan giữa các vị trí đột biến điểm trên gen dhfr với kết quả đánh giá trên in vivo và in vitro đã chứng minh đột biến điểm tại vị trí 108 có vai trị quan trọng nhất đối với kiểu hình kháng của P. falciparum với pyrimethamin. Chỉ cần P. falciparum mang đột biến

đơn ở vị trí 108Ser108Asn thì KSTSR kháng pyrimethamin. Tuy nhiên đột biến này xuất hiện cùng với đột biến điểm tại các vị trí 51, 59 và 164 làm tăng mức độ kháng. Mức độ kháng tăng lên khi số l-ợng đột biến tăng [68, 69,

124]. Tổng hợp các kết quả phân tích mối t-ơng quan giữa đột biến trên gen

dhfr và thử nghiệm in vitro của một số chủng và phân lập chuẩn từ một số

n-ớc trên thế giới đáp ứng với pyrimethamin (Bảng 1.7).

Bảng 1.7. Mối liên quan giữa đột biến điểm trên gen dhfr và đáp ứng với

pyrimethamin trên in vitro của một số chủng, phân lập chuẩn Chủng/

phân lập 51 59 108 164

Nồng độ

IC50 Đáp ứng 3D7 (Châu Phi) Asn Cys Ser Ile 0.7 Nhạy

HB3 (Honduras) Asn Cys Asn Ile 730 Kháng

Lt.D12 (Bra-xin) Ile Cys Asn Ile 2900 Kháng

K1 (Thái Lan) Asn Arg Asn Ile 1048 Kháng

W2 (Đông D-ơng) Ile Arg Asn Ile 1100 Kháng

V1/S (Việt Nam) Ile Arg Asn Leu 2800 Kháng (Theo kết quả của Peterson D. S. và cs 1989 [124])

1.7.5.2. Cơ chế kháng thuốc của P. falciparum đối với sulfadoxin

Giải trình tự gen dhps (dihydropteroate synthase gene) ở chủng P. falciparum kháng sulfadoxin cho thấy đột biến ở các vị trí 436, 437, 540, 581

và 613 có liên quan chặt chẽ với P. falciparum kháng sulfadoxin (Bảng 1.8),

trong đó đột biến ở vị trí 540 chủ yếu phát hiện đ-ợc tại Châu Phi, một số ít ở Châu Mỹ [73, 145, 151].

Nhiều kết quả nghiên cứu đã khẳng định hai điểm đột biến quan trọng là 581 và 613, chỉ cần đột biến một trong 2 điểm này cũng tạo ra kháng. Trong khi đó nếu đột biến 2 điểm 436 và 437 cũng không gây ra kháng. Nếu có đột biến một trong hai điểm 581 hoặc 613 hoặc cả hai kèm theo các điểm đột biến 436, 437 hoặc cả 2 thì mức độ kháng tăng cao [113, 126, 146].

Bảng 1.8. Đột biến điểm trên gen dhps của P. falciparum liên quan đến

kháng sulfadoxin

Sự thay đổi axit amin một số vị trí do đột biến trên gen dhps

Vị trí Kiểu nhạy Kiểu đột biến

436 Serin (Ser) Phelyalanin (Phe)

437 Alanin (Ala) Glycin (Gly)

581 Alanin (Ala) Glycin (Gly)

613 Alanin (Ala) Serin (Ser)

Tổng hợp kết quả phân tích mối t-ơng quan đáp ứng với sulfadoxin của một số đơn dòng và phân lập chuẩn giữa các đột biến trên gen dhps và thử

nghiệm in vitro từ một số n-ớc trên thế giới (Bảng 1.9).

Bảng 1.9. Mối liên quan giữa đột biến điểm trên gen dhps và đáp ứng với

sulfadoxin trên in vitro của một số chủng, phân lập chuẩn Đơn dòng/

Phân lập 436 437 581 613

Nồng độ ức

chế (IC50) ng/ml Đáp ứng 3D7 (Nam Phi) Ser Gly Ala Ala (73  53 ng/ml) Nhạy HB3 (Hon-đu-rát) Ser Ala Ala Ala 4.0  1.9 ng/ml Nhạy K1 (Thái Lan) Ser Gly Gly Ala 223  36 ng/ml Kháng W2 (Đông D-ơng) Phe Gly Ala Ser 3970  1194 ng/ml Kháng Mùi (Việt Nam) Phe Gly Ala Ser 3970  1194 ng/ml Kháng

(Theo kết quả nghiên cứu của Wang P. và cs 1997 [146])

1.7.5.3. Cơ chế kháng thuốc của P. falciparum đối với chloroquin

Có nhiều gen tham gia vào kháng chloroquin nh- gen đa kháng thuốc 1 (Plasmodium falciparum multi drug resistance1 gene - Pfmdr1), gen vận chuyển kháng chloroquin (Plasmodium falciparum chloroquin resistance transporter – Pfcrt), chúng đ-ợc phân bố trên các nhiễm sắc thể số 5 và 7

[86, 93]. Các gen này mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình vận chuyển chloroquin đi vào, ra qua màng nguyên sinh chất của KST. Đến nay, nhiều kết quả nghiên cứu đã xác định các điểm đột biến trên gen Pfmdr1 nh- tại các vị trí: N86Y, F184Y, S1034C, D1042N, D1246Y chỉ có vai trị điều chỉnh mức độ kháng chloroquin và tham gia vào kháng một số thuốc khác nh- quinin, mefloquin, halofantrin và có thể cả artemisinin [86, 100].

Gen Pfcrt có nhiều đột biến điểm liên quan đến sự đáp ứng chloroquin của P. falciparum nh- tại các điểm M74I, N75E, K76T, A220S, Q271E,

N326S, I356T, R371I. Nh-ng chỉ có sự thay đổi tại điểm 76 là có ý nghĩa quan trọng nhất, liên quan đến sự đáp ứng với chloroquin của P. falciparum

trong cả in vitro và in vivo đối với các phân lập ở thực địa cũng nh- các chủng ở phịng thí nghiệm [86].

1.7.6. Một số kết quả nghiên cứu phân tích đột biến gen của P. falciparum kháng thuốc sốt rét

1.7.6.1. Kết quả của một số nghiên cứu trên thế giới

Đến nay, có nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR xác định tỷ lệ đột biến gen liên quan đến P. falciparum kháng thuốc pyrimethamin và

sulfadoxin nh-: nghiên cứu tại ấn Độ năm 2003, phát hiện 87,5% mẫu mang đột biến kháng trên gen dhfr (55% mang 2 đột biến tại vị trí 59 và 108; 32,5% mang đột biến đơn tại vị trí 108); 15% mẫu mang đột biến trên gen dhps (10% mang 2 đột biến tại vị trí 436 và 613, 5% cịn lại mang đột biến tại vị trí 581) [71]. Tại Bắc Tan-da-ni-a (năm 2009) xác định có 96% số mẫu mang đột biến tại vị trí 51, 59 và 108 trên gen dhfr và trong đó có 55% số mẫu mang 3 đột

biến trong đó có vị trí 581 trên gen dhps [97]. Tại vùng Đơng Nam Mơ-dăm- bích năm 2009 có tỷ lệ mẫu mang đột biến kháng ở trên 2 gen dhfr và dhps

tăng nhanh từ 11% năm 2004 lên đến 75% năm 2008 (p < 0,0001) [130]. Nghiên cứu thống kê tình trạng kháng chloroquin ở một số n-ớc thuộc vùng cận sa mạc Sahara Châu Phi (năm 2011) cho thấy có tỷ lệ đột biến khác

nhau. Tại U-gan-đa, tỷ lệ mẫu bệnh nhân mang đột biến ở vị trí 76 trên gen

Pfcrt là gần 100% và duy trì trong suốt 10 năm. Tại Buốc-ki-na-Pha-xơ, tỷ lệ

đột biến kháng tăng nhẹ dao động từ 50 -70%. Tại Ghi-nê Bít-xao là khoảng 20% [94].

Tại khu vực Đông Nam á, nghiên cứu của Mayxay M. và cs (2007) tại 17 tỉnh của Lào cho thấy tỷ lệ đột biến ở vị trí 76 trên gen Pfcrt rất cao tại hầu hết các tỉnh với tỷ lệ chung là 85%. Các tỉnh thuộc khu vực phía Nam có tần suất đột biến thấp hơn, tỉnh thấp nhất là Khammonuane khoảng 56% [115].

1.7.6.2. Kết quả của một số nghiên cứu tại Việt Nam

Ngô Việt Thành và cs 1998, nghiên cứu đánh giá đáp ứng của P. falciparum với các thuốc sốt rét trên in vitro và kỹ thuật PCR tại Bình Ph-ớc.

Kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu bệnh nhân kháng chloroquin là 47,22% và có mối t-ơng quan chặt với kết quả thử nghiệm trên in vitro (tỷ lệ 100%). Tỷ lệ kháng pyrimethamin là 79,95% và đa số các mẫu kháng pyrimethamin phát hiện có 3 điểm đột biến trở lên. Tỷ lệ kháng sulfadoxin là 63,16% [44].

Năm 2007, Bùi Quang Phúc và cs nghiên cứu KSTSR kháng sulfadoxin

– pyrimethamin tại tỉnh Ninh Thuận. Kết quả cho thấy KSTSR ở đây kháng mức độ cao với pryrimethamin với tỷ lệ kháng pryrimethamin là 89,6%, tỷ lệ kháng sulfadoxin là 22,9% [36].

Đoàn Hạnh Nhân và cs phân tích đột biến điểm ở vị trí 76 trên gen Pfcrt tại tỉnh Đắc Nơng cho kết quả 34,4% số mẫu mang kiểu dại, 54,2% mang kiểu đột biến và 11,4% nhiễm phối hợp. Kết quả đánh giá sự thay đổi axit amin tại vị trí 76 có liên quan chặt chẽ đến sự kháng chloroquin trên in vivo [33].

Phạm Nguyễn Thúy Vy và cs xác định tỷ lệ nhạy kháng chloroquin bằng xác định đột biến điểm tại vị trí 76 trên gen Pfcrt tại xã Đắk Nhau,

huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Ph-ớc đã phát hiện 17/26 (65,4%) mẫu mang đột biến kháng và 9/26 (34,6%) còn nhạy với chloroquin [59].

Ch-ơng 2 - Đối t-ợng, vật liệu và ph-ơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối t-ợng nghiên cứu

- Ký sinh trùng sốt rét

- Ng-ời dân sống trong vùng sốt rét l-u hành

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1. Địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu ở thực địa: Điều tra thu mẫu tại 7 xã thuộc 3 huyện miền núi ở

ba tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn gồm :

+ Xã Pa Tầng, xã Xy, xã Thanh, huyện H-ớng Hóa, tỉnh Quảng Trị + Xã Ngân Thủy và xã Lâm Thủy, huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình + Xã Hồng Thủy và xã Hồng Vân, huyện A L-ới, tỉnh Thừa Thiên Huế - Nghiên cứu tại phịng thí nghiệm:

Các mẫu máu thu thập trên giấy thấm đ-ợc bảo quản, tách ADN và phân tích bằng kỹ thuật PCR tại phịng thí nghiệm của Khoa Sinh học Phân tử, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung -ơng.

2.2.2. Thời gian nghiên cứu

Từ năm 2008 đến năm 2012

2.3. Vật liệu nghiên cứu

2.3.1. Dụng cụ và hóa chất cho kỹ thuật xét nghiệm lam máu

+ Kính hiển vi, lam kính, kim chích máu, giá để lam, bơng + Dung dịch giemsa mẹ, dung dịch đệm, n-ớc cất, cồn 90o và 70o + Giấy thấm Whatman 3MM (để thu thập mẫu máu)

2.3.2. Thiết bị và hóa chất tách chiết ADN

+Tủ lạnh - 40C, -200C bảo quản mẫu và hóa chất

+ Các bộ micropipet (hãng Gilson – Pháp, Eppendorf - Đức)

+ Máy ly tâm tốc độ cao (Centrifuge 5415R - hãng Eppendorf - Đức) + Tủ ấm (hãng Menmert – Thổ Nhĩ Kỳ)

+ Máy lắc, máy khuấy từ Rotolab (hãng OSI, Pháp) + Cân phân tích kỹ thuật (hãng Sartorius - Đức) + Máy đo pH (HM-16S của hãng TOA, Nhật Bản)

+ ống Eppendorf 1,5 ml (hãng Corning -Mỹ, Watson-Nhật)

+ Đầu típ 1ml, 200l, 20l và 10l (Corning, Thermoscientific -Mỹ) + PBS; Saponin; Chelex resin 100, Ethanol... (hãng Sigma, Takara) + Bộ kít tách ADN (QIAamp DNA blood mini KIT - QIAGEN -Mỹ).

2.3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất để tiến hành phản ứng PCR

+ Máy PCR (AB 9700 hãng Applied Biosystems, Eppendorf Đức). + Các bộ micropipet (hãng Gilson – Pháp, Eppendorf-Đức)

+ Máy lắc Rotolab (hãng OSI- Pháp)

+ Tube PCR 0,2ml (hãng Corning, Thermoscientific- Mỹ)

+ Đầu típ 1ml, 200l, 20l và 10l (Corning, Thermoscientific -Mỹ) + Các cặp mồi để chẩn đốn, phân biệt 4 lồi KSTSR P. falciparum, P.

vivax, P. malariae, P. ovale.

+ Các cặp mồi xác định kiểu gen của P. falciparum ở locus msp1, msp2 và glurp.

+ Các cặp mồi xác định kiểu gen của P. vivax ở locus Pvcs và Pvmsp1. + Các cặp mồi xác định đột biến của P. falciparum kháng với một số

loại thuốc sốt rét.

Các mồi đ-ợc đặt tổng hợp từ hãng Geneworks - úc; Sigma, Invitrogen- Mỹ, Takara - Nhật. (Trình tự các cặp mồi đ-ợc trình bày ở phần sau) + dNTPs ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (hãng Fermentas - Đức)

+ Taq DNA- polymerase (Viện Sốt rét - KST - CTTƯ sản xuất)

+ 10 X PCR buffers, MgCl2 25 mM (hãng Fermentas - Đức) + Các enzym giới hạn AluI và BstNI (hãng Fermentas)

+ N-ớc khử ion (Viện Sốt rét - KST - CTTƯ sản xuất bằng hệ thống EASYpure II- hãng Thermoscientific- Đức)

+ Chứng d-ơng là các đơn dòng chuẩn nh-: K1, 3D7, D10, 7G8, W2, T96 (Nguồn từ Viện nghiên cứu Y học nhiệt đới, Tr-ờng đại học Nagasaki, Nhật Bản và Khoa Y học nhiệt đới, Tr-ờng đại học Mahidol, Thái Lan)

2.3.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất cho điện di phân tích kết quả PCR

+ Lị vi sóng

+ Bộ điện di (Mulpid-one- Nhật Bản, Apelex-Pháp) + Bộ micropipet (hãng Gilson), đèn soi gel (đèn UV)

+ Hệ thống chụp và phân tích ảnh Bioimaging systems SDS – 8000 + Máy in nhiệt Mitsubishi, giấy in nhiệt (Nhật)

+ Dung dịch đệm điện di TBE (1X, 10X)- Invitrogen-Mỹ + Agarose (TopVisionTM LE GQ, hãng Fermentas)

+ Dung dịch ethidium bromide 10mg/ml (hãng Sigma)

+ Các loại thang đo kích th-ớc phân tử ADN nh-: GenrulerTM100bp, 1kb, 50bp DNA ladder, Marker BR322 DNA/BsuRI, phiX174 DNA/BsuRI (HaeIII) Marker (hãng Fermentas)

2.4. Ph-ơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mơ tả và phân tích

2.4.2. Mẫu nghiên cứu

2.4.2.1. Ph-ơng pháp thu thập mẫu

- Tiến hành điều tra thu thập lam máu và mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3 MM ở ng-ời dân sống trong vùng sốt rét l-u hành tại 7 xã thuộc 3 huyện Lệ Thủy tỉnh Quảng Bình, H-ớng Hóa tỉnh Quảng Trị và huyện A L-ới tỉnh Thừa Thiên Huế. Lam máu và mẫu máu trên giấy thấm đ-ợc thu thập bằng cách lấy máu đầu ngón tay để làm tiêu bản lam máu, đồng thời lấy 30- 50 l máu nhỏ lên giấy Whatman3MM.

- Sử dụng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa theo kỹ thuật th-ờng quy của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung -ơng [55] để phát hiện và định loại KSTSR, bệnh nhân có KSTSR đ-ợc điều trị thuốc sốt rét theo phác đồ h-ớng dẫn điều trị của Bộ Y tế [2].

- Mẫu máu trên giấy thấm đ-ợc để khô tự nhiên. Mỗi mẫu máu bảo quản riêng biệt trong túi nylon. Do điều kiện khó khăn ở thực địa và do những chuyến đi dài ngày vào vùng sâu, vùng xa nên chúng tôi chú ý:

a/ Để tách rời riêng từng mẫu trong túi nylon tránh tạp nhiễm chéo.

b/ Điều kiện thực địa máu lâu khô, việc bảo quản mẫu địi hỏi để khơ hoàn toàn nhằm tránh đ-ợc vi khuẩn và nấm mốc phát triển. Khi để khô tự nhiên ở điều kiện thực địa phải tránh các loại côn trùng đến ăn (ruồi, muỗi, kiến …).

2.4.2.2. Ph-ơng pháp chọn mẫu

Chọn mẫu nghiên cứu có chủ đích

- Chọn mẫu để phân tích thành phần, cơ cấu lồi theo kỹ thuật PCR gồm: + 210 mẫu có KSTSR theo kết quả xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa ở 3

tỉnh đ-ợc phân tích định loại lồi bằng kỹ thuật PCR lồng.

+ Phân tích 1.174 mẫu âm tính theo kết quả xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa thu ở tỉnh Thừa Thiên Huế bằng kỹ thuật PCR.

- Chọn mẫu để phân tích kiểu gen, xác định tính đa hình của KSTSR gồm các mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum và P. vivax (ở cả mẫu nhiễm

đơn và nhiễm phối hợp) đ-ợc lựa chọn. Cụ thể nh- sau:

+ 162 mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum đ-ợc sử dụng để phân tích tính đa hình di truyền của quần thể P. falciparum.

+ 85 mẫu bệnh nhân nhiễm P. vivax đ-ợc sử dụng để phân tích tính đa hình di truyền của quần thể P. vivax.

- Lựa chọn mẫu phân tích đột biến kháng thuốc: 162 mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum đ-ợc sử dụng để phân tích đột biến điểm liên quan đến tính kháng một số loại thuốc sốt rét.

2.4.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.4.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa

Lấy máu đầu ngón tay làm tiêu bản giọt dày. Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch giemsa, soi và định loại KSTSR theo qui trình kỹ thuật của Viện Sốt rét - KST - CTTƯ [55].

2.4.3.2. Kỹ thuật tách ADN

Có nhiều ph-ơng pháp tách, tinh khiết ADN của KSTSR từ giấy thấm Whatman 3MM. Trong đề tài này, chúng tôi chọn 2 ph-ơng pháp tách, tinh khiết ADN cho 2 loại mẫu gồm:

- Tách ADN các mẫu thu thập từ ng-ời dân sống trong vùng sốt rét:

Tách ADN từ mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3MM bằng ph-ơng pháp sử dụng Chelex 100 theo Kain và Lannar năm 1991 và Plowe CV và cs 1995 [106, 125]. Qui trình tách chiết ADN đ-ợc tóm tắt nh- sau:

B-ớc 1: ủ mẫu giấy thấm có chứa máu bệnh nhân đã cắt nhỏ với 1ml dung dịch saponin 0,5% ở nhiệt độ 370C trong 30 phút. Li tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.

B-ớc 2: Rửa 3 lần, mỗi lần với 1ml dung dịch đệm PBS pH 7,4

B-ớc 3: Loại bỏ hết dịch nổi và thêm vào mỗi ống 100l dung dịch Chelex 10%, đun sôi trong thời gian 10 phút, Li tâm thu dịch nổi ADN và bảo quản ở nhiệt độ -200C cho đến khi đ-a vào phản ứng PCR.