VÞ trÝ KiĨu gen, Tû lƯ (%) Quảng Bình (n=67) Quảng Trị (n=81)
Thõa Thiªn HuÕ (n=14) 436 S/R/M 57/6/4 70/8/3 13/1/0 % 85,07/8,96/5,97 86,42/9,88/3,70 92,86/7,14/0 437 S/R/M 54/10/3 59/15/7 10/3/1 % 80,60/14,92/4,48 72,84/18,52/8,64 71,43/21,43/7,14 581 S/R/M 60/5/2 72/6/3 13/1/0 % 89,55/7,46/2,99 88,89/7,41/3,70 92,86/7,14/0 613 S/R/M 61/4/2 74/5/2 12/2/0 % 91,04/5,97/2,99 91,36/6,17/2,47 85,71/14,29/0
Kết quả phân tÝch 162 mÉu bƯnh nh©n nhiƠm P. falciparum ph¸t hiƯn
đ-ợc đột biến điểm ở cả 4 vị trí trên gen dhps, tû lƯ ®ét biÕn ở các vị trí có sự khác nhau. Kết quả thu đ-ợc ở vị trí 581 vµ 613 cho thÊy cã 130/162 mÉu (80,25%) mang kiĨu gen nh¹y, 23/162 mÉu (14,20%) mang kiĨu gen đột biến và 09/162 mẫu (5,55%) nhim phi hp cả kiểu nhạy và đột biến (B¶ng 3.23).
B¶ng 3.23. Tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhạy, kháng với sulfadoxin
Vị trí 581 và 613 Kiểu nhạy Kiểu đột biến Nhiễm phối hợp
Sè l-ỵng mÉu (162 mÉu) 130 23 09
Tû lÖ % 80,25 14,20 5,55
Đánh giá đáp øng thuèc Nhạy Kháng (19,75%)
Da trờn tn sut xuất hiện của kiểu gen nhạy và kiểu đột biến trong tất cả các mẫu bệnh nhân để tính tỷ lệ KST nhạy và kháng trong quần thể. Tổng số xác định có 171 lần xuất hiện của KST nhạy và KST mang đột biến. Trong ®ã tû lƯ KST mang kiĨu gen ®ét biÕn kh¸ng víi sulfadoxin cđa qn thĨ P. falciparum tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam là 18,71% (Bảng 3.24).
B¶ng 3.24. Tû lƯ ký sinh trïng P. falciparum mang kiĨu gen nh¹y, kiĨu gen
đột biến kháng với thc sulfadoxin trong qn thĨ
Gen dhps KiĨu gen nh¹y KiĨu ®ét biÕn
Sè l-ỵng 139 32
Tû lƯ % 81,29 18,71
Tỉng 171
¶nh ®iƯn di s¶n phÈm PCR cđa mét sè mÉu bƯnh nhân mang kiểu gen nhạy và kiểu đột biến ở vị trí 581 và 613 trªn gen dhps đ-ợc thể hiện ở Hình 3.26 vµ 3.27.
Hình 3.26. ảnh điện di phát hiện đột biến ở vị trí 581 cña gen dhps
L : Thang chuÈn 50 bp 3D7, K1,: chøng d-ơng nhy, khỏng (-): chng âm B46: mẫu mang đột biến kháng B51: mÉu mang kiĨu gen nh¹y
B47, 54: các mẫu nhiễm phối hợp cả kiểu nhạy và đột biến
L 3D7 K1 (-) B46 B 47 B51 B54
S R S R S R S R S R S R S R
800 bp 600 bp
H×nh 3.27. ảnh điện di phát hiện đột biến ở vị trí 613 của gen dhps
L : Thang chuÈn 50 bp T96, K1: chứng d-ơng nhay, kháng; (-) : chứng âm B62, 64, 66: Các mẫu mang kiu gen nhạy
B65,68: các mÉu mang kiĨu gen ®ét biÕn
Theo Wang P. và cs [146], Plowe C.V. và cs [126] các mÉu mang kiÓu gen nhạy ở cả 4 vị trÝ 463, 437, 581 vµ 613 đ-ợc đánh giá là còn nhạy với sulfadoxin t-¬ng øng víi IC50 = 7,0 ± 2,8 ng/ml, có đột biến ở vị trí 436 hoặc 437 thì chỉ giảm nhạy với sulfadoxin t-¬ng øng víi IC50 = 73 ± 5,3 ng/ml. các mẫu đột biến ở vị trí 581 hoặc 613 đ-ợc đánh giá là kháng với sulfadoxin và đột biến ở vị trí 581 hoặc 613 kết hợp với đột biến ở vị trí khác thì có mức kháng cao với sulfadoxin t-ơng ứng với IC50 = 3970 ± 1194 ng/ml.
Ph©n tÝch 162 mÉu bƯnh nh©n ë khu vùc Bắc Tr-ờng Sơn trên gen dhps cho thấy có 108 mẫu (66,67%) khơng mang đột biến nên đánh giá là cịn nhạy víi sulfadoxin, cã 22 mÉu (13,58%) cã ®ét biến ở vị trí 436 hoặc 437 nên chỉ giảm nhạy với sulfadoxin vµ cã 32 mÉu (19,75%) mang 2 hc 3 vị trí đột biến trong đó có vị trí 581 hoặc 613 đ-ợc đánh giá là kháng víi sulfadoxin. Trong ®ã cã 07 mẫu (4,32%) có 3 điểm đột biến -c ỏnh giá có mức kháng cao (Bảng 3.25). 428 bp 500 bp 300 bp L T96 W2 (-) B62 B64 B65 B66 B68 S R S R S R S R S R S R S R S R
B¶ng 3.25. Số l-ợng đột biến điểm và mức độ đáp ứng với sulfadoxin
Kiểu phối hợp đột biến Sè l-ỵng mÉu
Tû lƯ
(%) Đáp ứng thuốc
Khơng có đột biến 108 66,67 Nh¹y (66,67%) Đột biến đơn ở vị trí 436 9 13,58 Giảm nhạy (13,58%) Đột biến đơn ở vị trí 437 13 §ét biến ở vị trí 581 và 436 6 15,43 Kh¸ng (15,43%) Đột biến ở vị trí 581 và 437 8 Đột biến ở vị trí 613 và 437 11 §ét biến ở vị trí 581, 436 và 437 3 4,32 Kh¸ng cao (4,32%) §ét biến ở vị trí 613 , 436 và 437 4
Sulfadoxin đ-ợc sử dụng rộng r·i ë ViƯt Nam d-íi dạng hợp chất sulfadoxin và pyrimethamin (Fansidar) từ những năm 1964 để điều trị những tr-ờng hợp P. falciparum kháng chloroquin [25]. Tuy nhiên Fansidar cũng đà bị kháng nhanh chóng ở vùng Tây Ngun và Đơng Nam Bộ. Theo Lê Đình Cơng (2000) [3] mức kháng in vivo chung đối với Fansidar là khoảng 37,3%,
trong đó Tây Nguyên và Đông Nam Bộ cã tû lƯ kh¸ng cao nhÊt tÝnh chung khoảng 47%, các khu vực khác có tỷ lệ kháng thÊp h¬n.
Kết quả nghiên cứu phát hiện tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum có đột biến kháng víi thc sulfadoxin t¹i 3 tØnh thc khu vùc Bắc Tr-ờng Sơn của chúng tơi xác định đ-ợc là 19,75%. T l KST cú đột biến kháng với sulfadoxin trong quần thể là 18,71%. So sánh với kết quả nghiên cøu kh¸ng thuèc sulfadoxin bằng kỹ thuật PCR của Ngơ Việt Thành và cs (1998) tại Bình Ph-ớc [44] xác định tỷ lệ mẫu mang đột biến kháng sulfadoxin lµ 11/19 (57,89%) cho thÊy cã sù kh¸c biƯt cã ý nghÜa thèng kª víi p < 0,001. B×nh Ph-íc là tỉnh trọng điểm của KSTSR kháng thuốc, hơn nữa nghiên cứu tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn tiến hành sau hơn 10 năm và ở địa điểm nghiên cứu khác,
®ång thêi viƯc ngõng sư dơng Fansidar trong thời gian dài có thể làm giảm áp lực của thuốc điều trị nên tỷ lệ đột biến kháng có sự khác biệt.
Tû lƯ mÉu bƯnh nh©n nhiƠm P. falciparum có đột biến kháng sulfadoxin ở khu vực Bắc Tr-ờng Sơn t-ơng đồng với kết quả nghiên cứu của Bùi Quang Phúc và cs (2006) tại Ninh Thuận là 22,9% [40]. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu đánh giá hiệu lc điu trị ca thc Fansidar của Nông Thị Tiến và cs (2001) [51] trên in vivo xác định tû lƯ kh¸ng rÊt thÊp ë x· Thanh, huyện H-ớng Hóa tỉnh Quảng Trị là 13,2%.
3.4.3. Tû lƯ ®ét biÕn cđa P. falciparum kh¸ng thc chloroquin
Ký sinh trïng sèt rÐt P. falciparum kh¸ng chloroquin cã liên quan chặt
chÏ víi ®iĨm ®ét biÕn tại vị trí 76 trên gen vËn chun kh¸ng chlorquin (Pfcrt). Tại vị trí này KST nhạy mang axit amin Lysine, khi bị đột biến thành Threonine thì KST kháng với chloroquin.
Sư dơng kü tht PCR với các cặp mồi đặc hiệu để phân tích 162 mẫu máu bnh nhân nhim P. falciparum thu thËp t¹i khu vùc Bắc Tr-ờng Sơn,
Việt Nam ở vị trí 76 trên gen Pfcrt. KÕt quả đ-ợc trình bày ở Bảng 3.26.
B¶ng 3.26. KÕt quả phân tích đột biến điểm 76 trên gen Pfcrt
Địa điểm Gen Pfcrt Nhạy Kháng Phối hp n Tû lÖ (%) n Tû lÖ (%) n Tû lƯ (%) Quảng Bình (n=67) 27 40,30 29 43,28 11 16,42 Quảng Trị (n=81) 39 48,15 25 30,86 17 20,99
Thõa Thiªn HuÕ (n=14) 5 35,71 6 42,86 3 21,43
Trong tæng sè 162 mẫu đ-ợc phân tích phát hiện có 71 mẫu (43,83%) cịn nhạy víi chloroquin, 60 mÉu (37,04%) mang kiĨu gen ®ét biÕn vµ 31 (19,13%) mẫu nhiễm phối hợp cả ký sinh trùng nhạy và kh¸ng. Tû lƯ mÉu bƯnh nh©n nhiƠm P. falciparum kháng với chloroquin là 91/162 mÉu bƯnh
nh©n chiÕm tû lƯ 56,17% (B¶ng 3.27).
B¶ng 3.27. Tû lệ mẫu bệnh nhân nhạy và kháng với chloroquin VÞ trÝ 76 Kiểu nhạy Kiểu đột biến Nhiễm phèi hỵp
Sè l-ỵng mÉu (162 mÉu) 71 60 31
Tû lÖ % 43,83 37,04 19,13
Đánh giá đáp ứng thuốc Nhạy Kháng (56,17%)
Tû lÖ KST mang kiểu gen nhạy và kiĨu gen kh¸ng chloroquin trong quần thể đ-ợc xác định dựa trên tần suất xuất hiện của kiểu gen nhạy và kiểu đột biến trong tất cả các mẫu bệnh nhân (Bảng 3.28).
B¶ng 3.28. Tû lƯ P. falciparum mang kiểu gen nhạy và kiểu gen đột biến
kháng với thc chloroquin trong qn thĨ
Gen Pfcrt KiĨu gen nhạy Kiu đột biến
Số l-ng 102 91
Tû lƯ % 52,85 47,15
Tỉng 193
B¶ng 3.28 cho thÊy ë qn thĨ P. falciparum tại khu vực Bắc Tr-ờng
S¬n ViƯt Nam tû lƯ KST mang kiểu gen nhạy là 52,85% và kiu gen đột biến kháng với chloroquin l 47,15%.
Kt qu đin di sản phẩm PCR ca một số mÉu bƯnh nhân mang kiểu gen nhạy và kiểu đột biến ở vị trí 76 trên gen Pfcrt đ-ợc thể hin Hỡnh 3.28.
Hình 3.28. ảnh đin di phát hin đột biến kháng đối với chloroquin
L: Thang chuÈn 100bp T96, K1: Chứng d-ơng chuẩn nhạy, kh¸ng chloroquin MÉu T4: Mẫu bệnh nhân mang KST nhạy
Các mẫu T1, 4, 6,7: Các bệnh nhân mang KST kháng T5: Bệnh nhân nhiễm phối hợp cả chủng nhạy và kháng
Chloroquin là thuốc lý t-ởng do có giá thành rẻ, dễ điều trị và có hiệu qu¶ cao. Nh-ng sau 50 năm sử dụng, hiệu quả điều trị của chloroquin giảm nhanh chãng do ph¸t triĨn kh¸ng thc. KSTSR P. falciparum kh¸ng thuèc chloroquin đ-ợc thông báo đầu tiên năm 1960 ở vùng biên giới Cô-lôm-bi-a và Vê-nê-du-ê-la (1961) và tiếp sau đó ở Thái Lan (1961) [76]. Trong 20 năm,
P. falciparum kháng chloroquin đà lan ra nhiỊu vïng trên thế giới. Mức độ
khỏng có xu h-ớng tăng theo thời gian dùng thuốc liên quan tới áp lực điều trị của thuốc và tình hình lan truyền sốt rét. Kháng chloroquin đ-ợc ghi nhận với mức độ kháng khác nhau ë nhiỊu vïng trªn thế giới. Những năm 1990, chloroquin bị kháng mạnh nhất ở Thái Lan, Cam-pu-chia vµ ViƯt Nam (th-êng trªn 90% in vitro), thấp nhất ở Dăm-bi-a; vùng kh¸ng cao th-êng
trïng víi vïng cã ph©n bố muỗi An. dirus. Theo dâi kh¸ng thc ph¸t triĨn
b»ng thư nghiƯm in vitro cho thấy hiệu lực điều trị của chloroquin giảm nhanh ở những vùng có áp lực thuốc mạnh. Đặc biệt là ở vùng sốt rét l-u hành nặng,
L T96 K1 T1 T3 T4 T5 T6 T7
S R S R S R S R S R S R S R S R
500 bp
P. falciparum kh¸ng víi chloroquin có -u thế sinh học hơn dịng nhạy và có
tính h-ớng với muỗi cao h¬n [101].
B»ng kü thuật PCR có thể xác định đ-ợc tỷ lệ bệnh nhân mang đột biến kháng víi chloroquin vµ tû lƯ KST P. falciparum mang kiÓu gen ®ét biÕn trong qn thĨ do vËy có thể -ớc l-ợng đ-ợc tình trạng kháng thuốc chloroquin trong cộng đồng.
Phân tích 162 mÉu bƯnh nh©n nhiƠm P. falciparum ë khu vùc B¾c
Tr-êng S¬n cho thÊy cã 56,17% sè mÉu bệnh nhân mang đột biến kháng với chloroquin. Tû lƯ KSTSR mang kiĨu gen ®ét biến trong quần thể là 47,15%. Tû lƯ bƯnh nh©n nhiƠm phèi hợp kiểu nhy v kiu đột biến là 19,14%. KÕt quả nghiên cứu ở khu vực Bắc Tr-ờng Sơn cho thấy có sự t-ơng đồng với kết quả nghiên cứu trên in vivo vµ in vitro của Triệu Nguyên Trung và cs (1999)
[54] đánh giá hiệu lực điều trị của một số thuốc điều trị sốt rét tại miÒn Trung
– Tây Nguyên phát hiÖn tû lÖ P. falciparum kháng với chloroquin tại Bè
Trạch, Quảng Bình là 65,79%. Theo Ngô Việt Thành và cs (2000) [44] tại Bình Ph-ớc phát hiƯn tû lƯ bƯnh nh©n kháng chloroquin trên in vitro là
61,11%. Các kết quả trên cũng cho thÊy mỈc dï sau nhiỊu năm chloroquin không đ-ợc dùng để điều trị cho bệnh nhân nhiễm P. falciparum, áp lực điều trị của thc gi¶m nh-ng tû lƯ KSTSR P. falciparum mang kiĨu gen đột biến kháng ở khu vực này vẫn duy trì mức ở mức cao.
Mét sè kÕt qu¶ nghiên cứu xác định đột biến kháng bằng kỹ thuật PCR đ-ợc tiến hành trên các khu vực khác nhau nh- nghiên cứu của Đoàn Hạnh Nhân và cs (2008) [33] phân tích 35 mẫu bệnh nhân tại Đắc Nông phát hiện cã 34,4% mÉu mang kiĨu d¹i, 54,2% mÉu mang kiểu đột biến và 11,4% nhiễm phối hợp; Phạm Nguyễn Thúy Vy và cs (2010) [59] phân tích 26 mẫu bƯnh nh©n nhiƠm P. falciparum t¹i Bình Ph-ớc đà phát hiện 65,4% mẫu mang đột biến kháng và 34,6% mang kiểu dại và kết quả phân tích ở khu vực Bắc
Tr-êng Sơn là 56,17% cho thấy tû lƯ bƯnh nh©n nhiƠm P. falciparum mang
®ét biÕn kháng cịn rất cao tại nhiều vùng trong cả n-ớc.
Các nghiên cứu tại nhiều vùng khác nhau trên thế giới cũng cho thấy P.
falciparum cã tÇn suÊt xuÊt hiện đột biến cao và khác nhau nh- tại Uganda tû
lÖ bÖnh nhân mang kiểu gen đột biến chiến gần 100% và duy tr× trong thêi gian dài 10 năm [86], tại Buốc-ki-na-Pha-xô tần suất xuất hiện đột biến kháng dao động từ 50% đến 70% [122], tại Ghi-nê Bít-xao tần suất đột biến thấp hơn khoảng 20% [99], tại Lào trong một nghiên cøu tiÕn hµnh ë 17 tØnh cho thÊy tû lƯ ®ét biÕn chung lµ 85% (713/836 mÉu) trong ®ã thÊp nhÊt ë tØnh Khammonuan cã ®-êng biên giới giáp với khu vực Bắc Tr-ờng, Sơn Việt Nam lµ 56% [115].
Các tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam trải dài khoảng 500 ki lô mét dọc theo chiều dài đất n-ớc, có biên giới giáp với n-ớc bạn Lào. Khu vùc nµy với những điều kiện tự nhiên, xà hội và văn hóa có nhiều nét đặc tr-ng riêng biệt. Đây là khu vực có nhiều thuận lợi cho các hoạt động giao l-u kinh tế, văn hóa với các vùng miền trong cả n-ớc và với n-ớc bạn Lào nh-ng cũng đem lại nhiều thách thức cho cơng tác phịng chống sốt rét.
Kết quả nghiên cứu của đề tài đà chỉ ra tại khu vực này tỷ lệ lam máu xÐt nghiÖm cã KSTSR tÝnh chung cho c¶ 3 tØnh qua các đợt điều tra từ năm 2008 đến 2011 là 3,65%, có mặt 3 lồi ký sinh trùng sốt rét lµ P. falciparum,
P. vivax và P. malariae trong đó P. falciparum là loµi tréi nhÊt, P. malariae
chiÕm tØ lƯ rÊt thÊp. Tû lƯ nhiễm phối hợp các lồi KSTSR trên bệnh nhân là 17,75% cho thÊy t×nh h×nh lan truyền sốt rét của khu vực Bắc Tr-ờng Sơn còn cao và phức tạp, có sự đa dạng về thành phần lồi. Tỷ lệ nhiễm phối hợp trên bệnh nh©n cao cho thÊy møc độ truyền nhiễm cao và gây nhiều khó khăn trong điều trị cũng nh- ngăn chặn ngn bƯnh l©y nhiƠm bƯnh.
Kết quả phân tích tính đa hình di truyền của KSTSR P. falciparum vµ P.
có tính đa hình cao, với sự đa dạng về kiểu gen và chứa nhiều alen khác nhau và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với kết quả phân tích đa hình tại một số vùng khác ở n-ớc ta và một số quốc gia khác trên thế giới. Kết quả xác định tû lƯ nhiƠm phèi hỵp kiểu gen và giá trị MOI của khu vực này t-ơng đồng với kết quả của một số nghiên cứu ở các vùng có sự lan truyền sốt rét trung bình trên thế giới. Mức độ đa hình của các quần thể KST cũng phản ánh mức độ phức tạp của tình hình lan truyền sốt rét tại đây và cũng cho thấy những khó khăn rất lớn trong h-ớng phát triển nghiên cứu vắc xin đặc hiệu cho các quần thể KST tại khu vực này.
Kết quả phân tích tính kháng thuốc cña KST P. falciparum víi
pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin dựa trên các đột biến điểm cho thấy mặc dù đà nhiều năm chúng ta không sử dụng các loại thuốc này trong iu tr
bnh nhân sốt rét nhim P. falciparum. áp lùc cđa viƯc sư dơng thc gi¶m, nh-ng quần thể KST ở đây vẫn còn mang tỷ lệ đột biến kháng rất cao đặc biệt là đối với pyrimethamin. HiÖn nay, P. falciparum kh¸ng víi artemisinin (mét thành phần rất quan trọng trong thuốc điều trị sốt rét hiện nay) đà đ-ợc thông