Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.4. Ph-ơng pháp nghiên cứu

2.4.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.4.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa

Lấy máu đầu ngón tay làm tiêu bản giọt dày. Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch giemsa, soi và định loại KSTSR theo qui trình kỹ thuật của Viện Sốt rét - KST - CTTƯ [55].

2.4.3.2. Kỹ thuật tách ADN

Có nhiều ph-ơng pháp tách, tinh khiết ADN của KSTSR từ giấy thấm Whatman 3MM. Trong đề tài này, chúng tôi chọn 2 ph-ơng pháp tách, tinh khiết ADN cho 2 loại mẫu gồm:

- Tách ADN các mẫu thu thập từ ng-ời dân sống trong vùng sốt rét:

Tách ADN từ mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3MM bằng ph-ơng pháp sử dụng Chelex 100 theo Kain và Lannar năm 1991 và Plowe CV và cs 1995 [106, 125]. Qui trình tách chiết ADN đ-ợc tóm tắt nh- sau:

B-ớc 1: ủ mẫu giấy thấm có chứa máu bệnh nhân đã cắt nhỏ với 1ml dung dịch saponin 0,5% ở nhiệt độ 370C trong 30 phút. Li tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.

B-ớc 2: Rửa 3 lần, mỗi lần với 1ml dung dịch đệm PBS pH 7,4

B-ớc 3: Loại bỏ hết dịch nổi và thêm vào mỗi ống 100l dung dịch Chelex 10%, đun sôi trong thời gian 10 phút, Li tâm thu dịch nổi ADN và bảo quản ở nhiệt độ -200C cho đến khi đ-a vào phản ứng PCR.

- Tách ADN các mẫu máu đã xác định có KSTSR bằng soi kính hiển vi:

Các mẫu có KSTSR theo kết quả xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa đ-ợc tách và tinh sạch ADN bằng bộ kít QIAamp DNA blood mini. Qui trình tách ADN theo h-ớng dẫn của nhà sản xuất (Hãng QIAGEN).

2.4.3.3. Kỹ thuật PCR lồng chẩn đốn, phân biệt bốn lồi KSTSR

áp dụng kỹ thuật PCR lồng và trình tự mồi theo Snounou G. và cs (1993) [136] để chẩn đốn, phân biệt 4 lồi KSTSR trên ng-ời.

- Phản ứng PCR để nhân bản đoạn gen đặc hiệu cho giống Plasmodium (gọi là Nest 1). Cặp mồi sử dụng cho Nest 1 ký hiệu là PLU5 và PLU6 có trình tự nh- sau:

PLU5: 5'-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC-3' PLU6: 5'-TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG-3'

+ Thành phần phản ứng Nest 1 với tổng thể tích 25 l nh- sau: 10 x PCR buffer (15 mM MgCl2) 2,5 l

dNTPs (2,0 mM) 2,5 l PLU5 (1,25 M) 1,0 l PLU6 (1,25 M) 1,0 l

Taq DNA polymerase (1 đơn vị) 1,0 l Dịch chiết ADN 3,0 l H2O 14,0 l

+ Chu trình nhiệt của phản ứng Nest 1 nh- sau: 950C - 5 phút, tiếp theo 25 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 580C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút.

- Phản ứng Nest 2 để nhân bản gen đặc hiệu cho từng loài KSTSR. Sử dụng các cặp mồi FAL1 và FAL2, VIV1 và VIV2, MAL1 và MAL2, OVA1 và OVA2. Trình tự các cặp mồi nh- sau:

FAL1: 5'- TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT -3' FAL2: 5'-ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3' VIV1: 5'-CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC-3' VIV2: 5'-ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA-3' MAL1: 5'-ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC-3' MAL2: 5'-AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA-3' OVA1: 5'-ATC TCT TTT GCT ATT TTT TAG TAT TGG AGA-3' OVA2: 5'-GGA AAA GGA CAC ATT AAT TGT ATC CTA GTG-3'

+ Thành phần phản ứng Nest 2 nh- Nest 1, chỉ khác là lấy 01l ADN khuôn từ sản phẩm Nest 1 và các cặp mồi t-ơng ứng cho 4 loài KSTSR.

+ Chu trình nhiệt của phản ứng Nest 2 nh- Nest 1 nh-ng đ-ợc tiến hành trong 30 chu kỳ. Sơ đồ kỹ thuật PCR lồng chẩn đốn, phân biệt 4 lồi KSTSR trong máu ng-ời đ-ợc mơ tả ở Hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ kỹ thuật PCR lồng chẩn đốn, phân biệt 4 lồi KSTSR

2.4.3.4. Kỹ thuật PCR xác định đa hình di truyền kiểu gen của P. falciparum

áp dụng kỹ thuật PCR và trình tự mồi theo Snounou G. và cs (1999) [139] để xác định kiểu gen của P. falciparum dựa trên ba locus msp1, msp2 và

glurp.

- Phản ứng Nest 1 sử dụng các đơi mồi có trình tự nh- sau:

M1-OF: 5'- CTA GAA GCT TTA GAA GAT GCA GTA TTG -3' M1-OR: 5'- CTT AAA TAG TAT TCT AAT TCA AGT GGA TCA -3'

Plasmodium đặc hiệu

Sơ đồ phản ứng PCR lồng – nhân bản đặc hiệu gen

18S – rARN để xác định 4 loài KSTSR

M2-OF: 5'- ATG AGG GTA ATT AAA ACA TTG TCT ATT ATA -3' M2-OR: 5'- CTT TGT TAC CAT CGG TAC ATT CTT -3'

G-OF: 5'- TGA ATT TGA AGA TGT TCA CAC TGA AC -3' G-OR: 5'- GTG GAA TTG CTT TTT CTT CAA CAC TAA -3'

Chu trình nhiệt của Nest 1 là: 950C - 5 phút, tiếp theo 25 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 580C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút. - Phản ứng Nest 2 sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tại Bảng 2.1 để xác định kiểu gen của P. falciparum.

Chu trình nhiệt của phản ứng Nest 2 là: 950C - 5 phút, tiếp theo 30 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 640C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút đối với các locus msp1, msp2 và 950C - 5 phút, tiếp theo 30 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 580C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút đối với locus glurp.

Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi nhân bản các kiểu gen của P. falciparum

Kiểu gen Mồi Trình tự

K1 M1-2KF M1-2KR

5'- AAA TGA AGA AGA AAT TAC TAC AAA AGG TGC -3' 5'- GCT TGC ATC AGC TGG AGG GCT TGC ACC AGA -3'

MAD20 M1-2MF M1-2MR

5'- AAA TGA AGG AAC AAG TGG AAC GAC TGT TAC -3' 5'- ATC TGA AGG ATT TGT ACG TCT TGA ATT ACC -3'

RO33 M1-2RF M1-2RR

5'- TAA AGG ATG GAG CAA ATA CTC AAG TTG TTG -3' 5'- CAT CTG AAG GAT TTG CAG CAC CTG GCG ATC -3'

FC M2-FCF M2-FCR

5' - AAT ACT AAG AGT GTA GGT GCA AAT GCT CCA-3' 5' - TTT TAT TTG GTG CAT TGC CAG AAC TTG AAC-3'

IC M2-ICF M2-ICR

5'- AGA AGT ATG GCA GAA AGT AAG CCT CCT ACT-3' 5'- GAT TGT AAT TCG GGG GAT TCA GTT TGT TCG-3'

Glurp G-FN

G-OR

5'- TGT TCA CAC TGA ACA ATT AGA TTT AGA TCA -3' 5'- GTG GAA TTG CTT TTT CTT CAA CAC TAA -3'

Kỹ thuật PCR xác định kiểu gen của P. falciparum theo locus msp1, msp2 và glurp đ-ợc mơ tả tóm tắt ở Hình 2.2.

Hình 2.2. Sơ đồ kỹ thuật PCR xác định kiểu gen của P. falciparum

2.4.3.5. Kỹ thuật PCR xác định đa hình di truyền kiểu gen của P. vivax

áp dụng kỹ thuật PCR và trình tự mồi theo Imwong M. và cs 2005 [102] để phân tích kiểu gen của P. vivax dựa trên locus Pvcs và Pvmsp1.

* Kỹ thuật PCR lồng xác định kiểu gen của P. vivax theo locus Pvcs:

- Phản ứng Nest 1 sử dụng cặp mồi có trình tự là:

VCS-OF: 5’- ATGTAGATCTGTCCAAGGCCATAAA-3’

VCS-OR: 5’-TAATTGAATAATGCTAGGACTAACAATATG-3’ Chu trình nhiệt của Nest 1 là: 950C - 5 phút, tiếp theo 25 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 580C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút. - Phản ứng Nest 2 nhân bản kiểu gen Pvcs đặc hiệu, sử dụng cặp mồi có trình tự là:

VCS-NF: 5’-GCAGAACCAAAAAATCCACGTGAAAATAAG-3’ VCS-NR: 5’- CCAACGGTAGCTCTAACTTTATCTAGGTAT-3’

Chu trình nhiệt của Nest 2 là: 950C - 5 phút, tiếp theo 30 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 620C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút. Locus glurp alen Locus msp2 IC FC Locus msp1 K1 MAD20 RO33

Kỹ thuật PCR đa mồi nhân bản các locus gen

msp1, msp2 và glurp (Nest 1)

Kỹ thuật PCR xác định các kiểu gen ở locus msp1, msp2 và glurp sử dụng các cặp mồi đặc hiệu (Nest 2)

- Để xác định kiểu gen của P. vivax theo locus Pvcs, sau khi thu đ-ợc sản

phẩm PCR từ phản ứng Nest 2 thì sử dụng enzym giới hạn AluI cắt sản phẩm PCR để xác định kiểu gen VK210 và enzym giới hạn BstNI cắt sản phẩm PCR xác định kiểu gen VK247.

+ Thành phần tham gia phản ứng trong tổng thể tích 15 l nh- sau: Sản phẩm PCR của Nest 2: 5 l

Enzym AluI (10 đơn vị): 0,5 l 1X Tango buffers: 1,0 l N-ớc cất khử ion: 8,5 l + ủ mẫu ở nhiệt độ 370C trong 16 giờ

+ Thành phần và điều kiện phản ứng khi sử dụng enzym BstNI cũng

t-ơng tự nh- trên, sử dụng buffers theo h-ớng dẫn của nhà sản xuất.

* Kỹ thuật PCR lồng xác định kiểu gen của P. vivax theo locus Pvmsp1:

Ba đoạn F1, F2 và F3 của locus Pvmsp1 đ-ợc sử dụng để phân tích tính đa hình của P. vivax. Trong đó trình tự mồi và chu trình nhiệt của các đoạn

nh- sau:

Phân tích đoạn F1:

- Phản ứng Nest 1 sử dụng cặp mồi có trình tự là:

VM1-O1R: 5’- CCACTCCATGAAACTGAAGTGTTTA-3’

VM1-N1F: 5’- CGATATTGGAAAATTGGAGACCTTCATCAC-3’ Chu trình nhiệt của Nest 1 là: 950C - 5 phút, tiếp theo 25 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 640C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút. - Phản ứng Nest 2 sử dụng cặp mồi có trình tự là:

VM1-N1F: 5’- CGATATTGGAAAATTGGAGACCTTCATCAC-3’ VM1-N1R: 5’– CTTTTGCGCCTCCTCCAGCTGGCTCGTGT - 3’ Chu trình nhiệt của Nest 2 là: 950C - 5 phút, tiếp theo 30 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 640C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút.

Phân tích đoạn F2:

- Phản ứng Nest 1 sử dụng cặp mồi có trình tự là:

VM1-O2F: 5’– GATGGAAAGCAACCGAAGAAGGGAAT-3’ VM1-O2R: 5’ – AGCTTGTACTTTCCATAGTGGTCCAG-3’

Chu trình nhiệt của Nest 1 là: 950C - 5 phút, tiếp theo 25 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 600C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút. - Phản ứng Nest 2 sử dụng cặp mồi có trình tự là:

VM1-O2R: 5’ – AGCTTGTACTTTCCATAGTGGTCCAG-3’

VM1-N2F: 5’ – AAAATCGAGAGCATGATCGCCACTGAGAAG-3’ Chu trình nhiệt của Nest 2 là: 950C - 5 phút, tiếp theo 30 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 660C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút.

Phân tích đoạn F3:

Trình tự mồi cho nhân bản vùng F3 của locus Pvmsp1: VM1-3F: 5’– CAAGCCTACCAAGAATTGATCCCCAA-3’ VM1-3R: 5’ – ATTACTTGTCGTAGTCCTCGGCGTAGTCC-3’

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân bản đoạn F3 là: 950C - 5 phút, tiếp theo 35 chu kỳ gồm: 940C - 1 phút, 660C- 2 phút, 720C - 2 phút, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút.

2.4.3.6. Kỹ thuật PCR xác định P. falciparum kháng thuốc pyrimethamin

áp dụng kỹ thuật PCR 3 lần và trình tự các đơi mồi theo Masimirembwa C. M. và cs (1999) [114]. Hai phản ứng đầu nhằm tăng số l-ợng ADN khuôn. Phản ứng PCR lần 3 là phản ứng đặc hiệu xác định kiểu gen nhạy, kiểu đột biến.

- Phản ứng Nest 1 sử dụng cặp mồi có trình tự là:

AMP1: 5’-TTT ATA TTT TCT CCT TTT TA-3’ DF2: 5’-ACA ATT TTG TTC ATT TAA C-3’

Chu trình nhiệt của Nest 1 là: 940C - 3 phút, tiếp theo 20 chu kỳ gồm: 940C – 30 giây, 450C– 45 giây, 720C – 45 giây, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút. Sản phẩm PCR của Nest 1 là 736 bp.

- Phản ứng Nest 2 sử dụng cặp mồi có trình tự là:

SP1: 5’-ATG ATG GAA CAA GTC TGC GAC-3’ AMP2: 5’- CAT TTT ATT ATT CGT TTT CT-3’

Chu trình nhiệt của Nest 2 là: 940C - 3 phút, tiếp theo 30 chu kỳ gồm: 940C – 30 giây, 450C– 45 giây, 720C – 45 giây, tổng hợp lần cuối là 720C - 8 phút. Sản phẩm PCR của Nest 2 là 697 bp .

- Phản ứng PCR lần 3 xác định kiểu gen nhạy, kiểu gen đột biến của P. falciparum trên mẫu bệnh nhân đ-ợc thực hiện với 2 phản ứng trên 2 tube

PCR riêng biệt (1 tube cho kiểu gen nhạy, 1 tube cho kiểu đột biến). Sử dụng các cặp mồi cho từng vị trí đột biến theo Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi xác định kiểu gen nhạy và đột biến

ở các vị trí đột biến trên gen dhfr

Vị trí Mồi Trình tự Axit

amin

Kích th-ớc

AMP2 5’- CAT TTT ATT ATT CGT TTT CT-3’

Asn

565 bp

51N 5’-ATTACCATGGAAATGTAA-3’

AMP2 5’- CAT TTT ATT ATT CGT TTT CT-3’

Ile

51I 5’-ATTACCATGGAAATGTAT-3’