L : Thang chuẩn 50 bp T96, K1: chứng d-ơng nhay, kháng; (-) : chứng âm B62, 64, 66: Các mẫu mang kiểu gen nhạy
B65,68: các mẫu mang kiểu gen đột biến
Theo Wang P. và cs [146], Plowe C.V. và cs [126] các mẫu mang kiểu gen nhạy ở cả 4 vị trí 463, 437, 581 và 613 đ-ợc đánh giá là còn nhạy với sulfadoxin t-ơng ứng với IC50 = 7,0 ± 2,8 ng/ml, có đột biến ở vị trí 436 hoặc 437 thì chỉ giảm nhạy với sulfadoxin t-ơng ứng với IC50 = 73 ± 5,3 ng/ml. các mẫu đột biến ở vị trí 581 hoặc 613 đ-ợc đánh giá là kháng với sulfadoxin và đột biến ở vị trí 581 hoặc 613 kết hợp với đột biến ở vị trí khác thì có mức kháng cao với sulfadoxin t-ơng ứng với IC50 = 3970 ± 1194 ng/ml.
Phân tích 162 mẫu bệnh nhân ở khu vực Bắc Tr-ờng Sơn trên gen dhps cho thấy có 108 mẫu (66,67%) khơng mang đột biến nên đánh giá là còn nhạy với sulfadoxin, có 22 mẫu (13,58%) có đột biến ở vị trí 436 hoặc 437 nên chỉ giảm nhạy với sulfadoxin và có 32 mẫu (19,75%) mang 2 hoặc 3 vị trí đột biến trong đó có vị trí 581 hoặc 613 đ-ợc đánh giá là kháng với sulfadoxin. Trong đó có 07 mẫu (4,32%) có 3 điểm đột biến đ-ợc đánh giá có mức kháng cao (Bảng 3.25). 428 bp 500 bp 300 bp L T96 W2 (-) B62 B64 B65 B66 B68 S R S R S R S R S R S R S R S R
Bảng 3.25. Số l-ợng đột biến điểm và mức độ đáp ứng với sulfadoxin
Kiểu phối hợp đột biến Số l-ợng mẫu
Tỷ lệ
(%) Đáp ứng thuốc
Khơng có đột biến 108 66,67 Nhạy (66,67%) Đột biến đơn ở vị trí 436 9 13,58 Giảm nhạy (13,58%) Đột biến đơn ở vị trí 437 13 Đột biến ở vị trí 581 và 436 6 15,43 Kháng (15,43%) Đột biến ở vị trí 581 và 437 8 Đột biến ở vị trí 613 và 437 11 Đột biến ở vị trí 581, 436 và 437 3 4,32 Kháng cao (4,32%) Đột biến ở vị trí 613 , 436 và 437 4
Sulfadoxin đ-ợc sử dụng rộng rãi ở Việt Nam d-ới dạng hợp chất sulfadoxin và pyrimethamin (Fansidar) từ những năm 1964 để điều trị những tr-ờng hợp P. falciparum kháng chloroquin [25]. Tuy nhiên Fansidar cũng đã bị kháng nhanh chóng ở vùng Tây Ngun và Đơng Nam Bộ. Theo Lê Đình Công (2000) [3] mức kháng in vivo chung đối với Fansidar là khoảng 37,3%,
trong đó Tây Nguyên và Đông Nam Bộ có tỷ lệ kháng cao nhất tính chung khoảng 47%, các khu vực khác có tỷ lệ kháng thấp hơn.
Kết quả nghiên cứu phát hiện tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum có đột biến kháng với thuốc sulfadoxin tại 3 tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn của chúng tơi xác định đ-ợc là 19,75%. Tỷ lệ KST có đột biến kháng với sulfadoxin trong quần thể là 18,71%. So sánh với kết quả nghiên cứu kháng thuốc sulfadoxin bằng kỹ thuật PCR của Ngơ Việt Thành và cs (1998) tại Bình Ph-ớc [44] xác định tỷ lệ mẫu mang đột biến kháng sulfadoxin là 11/19 (57,89%) cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001. Bình Ph-ớc là tỉnh trọng điểm của KSTSR kháng thuốc, hơn nữa nghiên cứu tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn tiến hành sau hơn 10 năm và ở địa điểm nghiên cứu khác,
đồng thời việc ngừng sử dụng Fansidar trong thời gian dài có thể làm giảm áp lực của thuốc điều trị nên tỷ lệ đột biến kháng có sự khác biệt.
Tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum có đột biến kháng sulfadoxin ở khu vực Bắc Tr-ờng Sơn t-ơng đồng với kết quả nghiên cứu của Bùi Quang Phúc và cs (2006) tại Ninh Thuận là 22,9% [40]. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu đánh giá hiệu lực điều trị của thuốc Fansidar của Nông Thị Tiến và cs (2001) [51] trên in vivo xác định tỷ lệ kháng rất thấp ở xã Thanh, huyện H-ớng Hóa tỉnh Quảng Trị là 13,2%.
3.4.3. Tỷ lệ đột biến của P. falciparum kháng thuốc chloroquin
Ký sinh trùng sốt rét P. falciparum kháng chloroquin có liên quan chặt
chẽ với điểm đột biến tại vị trí 76 trên gen vận chuyển kháng chlorquin (Pfcrt). Tại vị trí này KST nhạy mang axit amin Lysine, khi bị đột biến thành Threonine thì KST kháng với chloroquin.
Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu để phân tích 162 mẫu máu bệnh nhân nhiễm P. falciparum thu thập tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn,
Việt Nam ở vị trí 76 trên gen Pfcrt. Kết quả đ-ợc trình bày ở Bảng 3.26.
Bảng 3.26. Kết quả phân tích đột biến điểm 76 trên gen Pfcrt
Địa điểm Gen Pfcrt Nhạy Kháng Phối hợp n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%) Quảng Bình (n=67) 27 40,30 29 43,28 11 16,42 Quảng Trị (n=81) 39 48,15 25 30,86 17 20,99
Thừa Thiên Huế (n=14) 5 35,71 6 42,86 3 21,43
Trong tổng số 162 mẫu đ-ợc phân tích phát hiện có 71 mẫu (43,83%) cịn nhạy với chloroquin, 60 mẫu (37,04%) mang kiểu gen đột biến và 31 (19,13%) mẫu nhiễm phối hợp cả ký sinh trùng nhạy và kháng. Tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum kháng với chloroquin là 91/162 mẫu bệnh
nhân chiếm tỷ lệ 56,17% (Bảng 3.27).
Bảng 3.27. Tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhạy và kháng với chloroquin Vị trí 76 Kiểu nhạy Kiểu đột biến Nhiễm phối hợp
Số l-ợng mẫu (162 mẫu) 71 60 31
Tỷ lệ % 43,83 37,04 19,13
Đánh giá đáp ứng thuốc Nhạy Kháng (56,17%)
Tỷ lệ KST mang kiểu gen nhạy và kiểu gen kháng chloroquin trong quần thể đ-ợc xác định dựa trên tần suất xuất hiện của kiểu gen nhạy và kiểu đột biến trong tất cả các mẫu bệnh nhân (Bảng 3.28).
Bảng 3.28. Tỷ lệ P. falciparum mang kiểu gen nhạy và kiểu gen đột biến
kháng với thuốc chloroquin trong quần thể
Gen Pfcrt Kiểu gen nhạy Kiểu đột biến
Số l-ợng 102 91
Tỷ lệ % 52,85 47,15
Tổng 193
Bảng 3.28 cho thấy ở quần thể P. falciparum tại khu vực Bắc Tr-ờng
Sơn Việt Nam tỷ lệ KST mang kiểu gen nhạy là 52,85% và kiểu gen đột biến kháng với chloroquin là 47,15%.
Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số mẫu bệnh nhân mang kiểu gen nhạy và kiểu đột biến ở vị trí 76 trên gen Pfcrt đ-ợc thể hiện ở Hình 3.28.
Hình 3.28. ảnh điện di phát hiện đột biến kháng đối với chloroquin
L: Thang chuẩn 100bp T96, K1: Chứng d-ơng chuẩn nhạy, kháng chloroquin Mẫu T4: Mẫu bệnh nhân mang KST nhạy
Các mẫu T1, 4, 6,7: Các bệnh nhân mang KST kháng T5: Bệnh nhân nhiễm phối hợp cả chủng nhạy và kháng
Chloroquin là thuốc lý t-ởng do có giá thành rẻ, dễ điều trị và có hiệu quả cao. Nh-ng sau 50 năm sử dụng, hiệu quả điều trị của chloroquin giảm nhanh chóng do phát triển kháng thuốc. KSTSR P. falciparum kháng thuốc chloroquin đ-ợc thông báo đầu tiên năm 1960 ở vùng biên giới Cô-lôm-bi-a và Vê-nê-du-ê-la (1961) và tiếp sau đó ở Thái Lan (1961) [76]. Trong 20 năm,
P. falciparum kháng chloroquin đã lan ra nhiều vùng trên thế giới. Mức độ
kháng có xu h-ớng tăng theo thời gian dùng thuốc liên quan tới áp lực điều trị của thuốc và tình hình lan truyền sốt rét. Kháng chloroquin đ-ợc ghi nhận với mức độ kháng khác nhau ở nhiều vùng trên thế giới. Những năm 1990, chloroquin bị kháng mạnh nhất ở Thái Lan, Cam-pu-chia và Việt Nam (th-ờng trên 90% in vitro), thấp nhất ở Dăm-bi-a; vùng kháng cao th-ờng
trùng với vùng có phân bố muỗi An. dirus. Theo dõi kháng thuốc phát triển
bằng thử nghiệm in vitro cho thấy hiệu lực điều trị của chloroquin giảm nhanh ở những vùng có áp lực thuốc mạnh. Đặc biệt là ở vùng sốt rét l-u hành nặng,
L T96 K1 T1 T3 T4 T5 T6 T7
S R S R S R S R S R S R S R S R
500 bp
P. falciparum kháng với chloroquin có -u thế sinh học hơn dịng nhạy và có
tính h-ớng với muỗi cao hơn [101].
Bằng kỹ thuật PCR có thể xác định đ-ợc tỷ lệ bệnh nhân mang đột biến kháng với chloroquin và tỷ lệ KST P. falciparum mang kiểu gen đột biến trong quần thể do vậy có thể -ớc l-ợng đ-ợc tình trạng kháng thuốc chloroquin trong cộng đồng.
Phân tích 162 mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum ở khu vực Bắc
Tr-ờng Sơn cho thấy có 56,17% số mẫu bệnh nhân mang đột biến kháng với chloroquin. Tỷ lệ KSTSR mang kiểu gen đột biến trong quần thể là 47,15%. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm phối hợp kiểu nhạy và kiểu đột biến là 19,14%. Kết quả nghiên cứu ở khu vực Bắc Tr-ờng Sơn cho thấy có sự t-ơng đồng với kết quả nghiên cứu trên in vivo và in vitro của Triệu Nguyên Trung và cs (1999)
[54] đánh giá hiệu lực điều trị của một số thuốc điều trị sốt rét tại miền Trung
– Tây Nguyên phát hiện tỷ lệ P. falciparum kháng với chloroquin tại Bố
Trạch, Quảng Bình là 65,79%. Theo Ngô Việt Thành và cs (2000) [44] tại Bình Ph-ớc phát hiện tỷ lệ bệnh nhân kháng chloroquin trên in vitro là
61,11%. Các kết quả trên cũng cho thấy mặc dù sau nhiều năm chloroquin không đ-ợc dùng để điều trị cho bệnh nhân nhiễm P. falciparum, áp lực điều trị của thuốc giảm nh-ng tỷ lệ KSTSR P. falciparum mang kiểu gen đột biến kháng ở khu vực này vẫn duy trì mức ở mức cao.
Một số kết quả nghiên cứu xác định đột biến kháng bằng kỹ thuật PCR đ-ợc tiến hành trên các khu vực khác nhau nh- nghiên cứu của Đoàn Hạnh Nhân và cs (2008) [33] phân tích 35 mẫu bệnh nhân tại Đắc Nơng phát hiện có 34,4% mẫu mang kiểu dại, 54,2% mẫu mang kiểu đột biến và 11,4% nhiễm phối hợp; Phạm Nguyễn Thúy Vy và cs (2010) [59] phân tích 26 mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum tại Bình Ph-ớc đã phát hiện 65,4% mẫu mang đột biến kháng và 34,6% mang kiểu dại và kết quả phân tích ở khu vực Bắc
Tr-ờng Sơn là 56,17% cho thấy tỷ lệ bệnh nhân nhiễm P. falciparum mang
đột biến kháng còn rất cao tại nhiều vùng trong cả n-ớc.
Các nghiên cứu tại nhiều vùng khác nhau trên thế giới cũng cho thấy P.
falciparum có tần suất xuất hiện đột biến cao và khác nhau nh- tại Uganda tỷ
lệ bệnh nhân mang kiểu gen đột biến chiến gần 100% và duy trì trong thời gian dài 10 năm [86], tại Buốc-ki-na-Pha-xô tần suất xuất hiện đột biến kháng dao động từ 50% đến 70% [122], tại Ghi-nê Bít-xao tần suất đột biến thấp hơn khoảng 20% [99], tại Lào trong một nghiên cứu tiến hành ở 17 tỉnh cho thấy tỷ lệ đột biến chung là 85% (713/836 mẫu) trong đó thấp nhất ở tỉnh Khammonuan có đ-ờng biên giới giáp với khu vực Bắc Tr-ờng, Sơn Việt Nam là 56% [115].
Các tỉnh thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam trải dài khoảng 500 ki lô mét dọc theo chiều dài đất n-ớc, có biên giới giáp với n-ớc bạn Lào. Khu vực này với những điều kiện tự nhiên, xã hội và văn hóa có nhiều nét đặc tr-ng riêng biệt. Đây là khu vực có nhiều thuận lợi cho các hoạt động giao l-u kinh tế, văn hóa với các vùng miền trong cả n-ớc và với n-ớc bạn Lào nh-ng cũng đem lại nhiều thách thức cho cơng tác phịng chống sốt rét.
Kết quả nghiên cứu của đề tài đã chỉ ra tại khu vực này tỷ lệ lam máu xét nghiệm có KSTSR tính chung cho cả 3 tỉnh qua các đợt điều tra từ năm 2008 đến 2011 là 3,65%, có mặt 3 lồi ký sinh trùng sốt rét là P. falciparum,
P. vivax và P. malariae trong đó P. falciparum là loài trội nhất, P. malariae
chiếm tỉ lệ rất thấp. Tỷ lệ nhiễm phối hợp các loài KSTSR trên bệnh nhân là 17,75% cho thấy tình hình lan truyền sốt rét của khu vực Bắc Tr-ờng Sơn còn cao và phức tạp, có sự đa dạng về thành phần lồi. Tỷ lệ nhiễm phối hợp trên bệnh nhân cao cho thấy mức độ truyền nhiễm cao và gây nhiều khó khăn trong điều trị cũng nh- ngăn chặn nguồn bệnh lây nhiễm bệnh.
Kết quả phân tích tính đa hình di truyền của KSTSR P. falciparum và P.
có tính đa hình cao, với sự đa dạng về kiểu gen và chứa nhiều alen khác nhau và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với kết quả phân tích đa hình tại một số vùng khác ở n-ớc ta và một số quốc gia khác trên thế giới. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm phối hợp kiểu gen và giá trị MOI của khu vực này t-ơng đồng với kết quả của một số nghiên cứu ở các vùng có sự lan truyền sốt rét trung bình trên thế giới. Mức độ đa hình của các quần thể KST cũng phản ánh mức độ phức tạp của tình hình lan truyền sốt rét tại đây và cũng cho thấy những khó khăn rất lớn trong h-ớng phát triển nghiên cứu vắc xin đặc hiệu cho các quần thể KST tại khu vực này.
Kết quả phân tích tính kháng thuốc của KST P. falciparum với
pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin dựa trên các đột biến điểm cho thấy mặc dù đã nhiều năm chúng ta không sử dụng các loại thuốc này trong điều trị
bệnh nhân sốt rét nhiễm P. falciparum. áp lực của việc sử dụng thuốc giảm, nh-ng quần thể KST ở đây vẫn còn mang tỷ lệ đột biến kháng rất cao đặc biệt là đối với pyrimethamin. Hiện nay, P. falciparum kháng với artemisinin (một thành phần rất quan trọng trong thuốc điều trị sốt rét hiện nay) đã đ-ợc thơng báo xảy ra tại tỉnh Bình Ph-ớc. Kết quả nghiên cứu của đề tài này tiếp tục góp phần cảnh báo sự phức tạp trong việc giải quyết KSTSR kháng thuốc nhất là khi tình trạng kháng thuốc lan rộng. Việc phòng chống và ngăn chặn KSTSR kháng thuốc cần đ-ợc -u tiên và kiểm soát đặc biệt nhằm giúp chúng ta đảm bảo tốt công tác điều trị cũng nh- thực hiện thành công Chiến l-ợc phòng chống và loại trừ sốt rét tại Việt Nam.
KếT LUậN Và KIếN NGHị
Kết luận
1. Thành phần, cơ cấu loài ký sinh trùng sốt rét tại 3 tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế thuộc khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam gồm có 3 lồi là P. falciparum, P. vivax và P. malariae. Trong đó P. faciparum
chiếm tỷ lệ là 60,44%, P. vivax chiếm tỷ lệ là 38,83% và P. malariae
chiếm tỷ lệ là 0,73%.
2. Quần thể P. falciparum và P. vivax tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam có tính đa hình di truyền cao. Trong đó:
- Đối với quần thể P. falciparum: ở locus msp1, xác định đ-ợc kiểu gen K1 chiếm tỷ lệ là 33,49%, kiểu gen MAD20 là 49,76% và kiểu gen RO33 là
16,75%. Tổng số đã phát hiện đ-ợc 29 alen, giá trị MOI là 1,40. ở locus
msp2, xác định đ-ợc kiểu gen FC chiếm tỷ lệ là 41,79% và kiểu gen IC
chiếm tỷ lệ 58,21%. Tổng số đã phát hiện đ-ợc 23 alen, giá trị MOI là
1,33. ở locus glurp, phát hiện đ-ợc 9 alen, giá trị MOI là 1,19.
- Đối với quần thể P. vivax: ở locus Pvcs, xác định đ-ợc kiểu gen VK210 chiếm tỷ lệ là 53,40% và kiểu gen VK247 là 46,60%. Tổng số phát hiện
đ-ợc 5 alen, giá trị MOI là 1,25. ở locus Pvmsp1, xác định có 3 alen với giá trị MOI là 1,25 ở đoạn F1, có 5 alen với giá trị MOI là 1,19 ở đoạn F2 và có 4 alen với giá trị MOI là 1,28 ở đoạn F3.
3. Quần thể P. falciparum tại khu vực Bắc Tr-ờng Sơn, Việt Nam có tỷ lệ đột biến kháng cao đối với pyrimethamin, sulfadoxin và chloroquin. Tỷ lệ kháng đối với từng loại thuốc là khác nhau.
- Đối với pyrimethamin: Tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum kháng
với pyrimethamin là 79,01%. Tỷ lệ P. falciparum mang kiểu gen đột biến kháng trong quần thể là 63,68%.
- Đối với sulfadoxin: Tỷ lệ mẫu bệnh nhân nhiễm P. falciparum kháng với sulfadoxin là 19,75%. Tỷ lệ P. falciparum mang kiểu gen đột biến kháng