- Zeolite: là loại alumino silicat kết tinh có thể gặp ở trạng thái tự nhiên hoặc tổng hợp bằng phương pháp nhân tạo.
3.2.6. Sắc ký ngược pha
Cơ chế tách trong sắc ký pha đảo ngược phụ thuộc vào sự tương tác liên kết kỵ nước giữa các phân tử chất tan trong pha động và các phối tử kỵ nước trong pha tĩnh.
Pha tĩnh:
Có nhiều pha tĩnh được sử dụng trong RPC tạo sự đa dạng cho các phương pháp tách.
Các chất trơ, khơng phân cực thường thích hợp để dùng làm pha tĩnh trong sắc ký ngược pha. Silica hoặc các polymer hữu cơ tổng hợp như polystyrene thường được sử dụng.
Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thơng thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):
Hình 3.5. Bề mặt silica đã thủy phân
Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.
Hình 3.6. Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4µmol/m2 bề mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể. Ngồi nhóm Cl, người ta cịn sử dụng –OCH3.
lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh.
Trong RPC, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như khơng phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) cịn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngồi ra cịn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.
Hình 3.7. Cấu trúc của ODS
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh cịn nhóm –OH chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy mơi trường pH phân tích.
Trong mơi trường q acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18) ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích khơng cịn tương tác tốt với pha tĩnh nữa.
Trong mơi trường bazơ (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hịa tan (SiO2 thành silicat), hệ quả là N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi rộng ra và thời gian lưu cũng có thể giảm. Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end-capping). Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính bazơ (cột LC-DB của hãng SUPELCO).
Hình 3.8. Cấu trúc của LD-BD
Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà khơng cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của nhóm –OH với chất cần phân tích.
Hình 3.9. Cấu trúc cột có nhóm isopropyl
Người ta cịn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity).
Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích trong mơi trường pH từ 1 – 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và bazơ mạnh.
Pha động:
thường pha động trong RPC bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Nước là một dung mơi rất phân cực nên nó khơng tương tác với những nhóm alkyl khơng phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của RPC.
Trên lý thuyết, chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung mơi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.
Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength),…
Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký.
Có ba thơng số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α. Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α. Đơi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh.
Trong quá trình tách của RPC, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính bazơ (nhận proton) của dung mơi.
Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột.
Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, ACN/nước hay THF/nước. Với một hỗn hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung mơi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải chọn các
hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước có độ rửa giải tương đồng. Thành phần pha động có thể cố định trong suốt q trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradient dung mơi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
Các thơng số ảnh hưởng đến q trình RPC:
+ Độ dài cột
Độ phân giải của các phân tử sinh học cao phân tử ít bị ảnh hưởng bởi chiều dài của cột hơn các phân tử hữu cơ phân tử bé. Protein, peptide và các acid nucleic có thể được tinh sạch hiệu quả trên các cột ngắn và việc tăng chiều dài cột không làm tăng hiệu quả đáng kể.
Với việc rửa giải bằng gradient, chiều dài cột không phải là yếu tố liên quan đến tốc độ rửa giải.
+ Tốc độ dòng chảy:
Tốc độ dòng chảy là yếu tố quan trọng đối với độ phân giải các phân tử nhỏ như các peptide mạch ngắn… Tuy nhiên, tốc độ dịng chảy cũng khơng tác động lớn đến các phân tử sinh học cao phân tử.
Trên thực tế, tốc độ chảy thấp, thường được sử dụng với các cột dài, thực sự có thể làm giảm độ phân giải do sự tăng khuếch tán theo chiều dọc của các phân tử chất tan khi chúng đi qua chiều dài của cột.
+ Nhiệt độ:
Nhiệt độ có thể ảnh hưởng nhiều đến q trình sắc ký ngược pha, đặc biệt là với các chất trọng lượng phân tử thấp như peptide ngắn và oligonucleotide. Độ nhớt của pha động giảm khi tăng nhiệt độ cột.
Các chất hữu cơ trong pha động:
Các dung môi hữu cơ được thêm vào để giảm sự phân cực của pha động ưa nước.
Thứ tự rửa giải có thể bị ảnh hưởng bởi thay đổi các loại hữu cơ. Sự rửa giải bị thay đổi, rõ rệt nhất là với protein đã bị biến tính trong các dung
mơi hữu cơ. Sự biến tính của protein có thể dẫn đến một sự thay đổi tính chất kỵ nước của nó.
Ứng dụng:
Ngoại trừ một vài ứng dụng cụ thể, sắc ký pha đảo ngược hiếm khi được sử dụng riêng lẻ trong việc tinh sạch các phân tử sinh học. Phương pháp này thường được kết hợp với các kỹ thuật sắc ký khác như sắc ký lọc gel, sắc ký HPLC. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật sắc ký HPLC, phương pháp này càng được sử dụng rộng rãi trong tinh sạch phân tử sinh học như peptide, protein và oligonucleotide.
Phương pháp này được sử dụng để tách một loạt các phân tử.
Tuy nhiên, phương pháp này ít được sử dụng riêng lẻ để tách các protein vì các dung mơi hữu cơ được sử dụng trong RPC có thể làm biến tính nhiều protein.