- Zeolite: là loại alumino silicat kết tinh có thể gặp ở trạng thái tự nhiên hoặc tổng hợp bằng phương pháp nhân tạo.
3.2.7.2. Các kỹ thuật sắc ký HPLC cơ bản
Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Partition Chromatography):
+ Pha tĩnh: Pha tĩnh trong sắc ký phân bố bao gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt của các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác. Các tiểu phân này thường có đường kính từ 3-10 μm, cỡ hạt có thể tăng đến 50 μm hoặc lớn hơn cho sắc ký điều chế. Sắc ký dùng loại pha tĩnh này được gọi là sắc ký lỏng - lỏng (Liquid – liquid Chromatography - LLC). Nhưng kiểu pha tĩnh này có nhược điểm là bị rửa trơi dần theo dịng pha động, kết quả là hiệu lực cột bị giảm dần trong quá trình sử dụng.
Để khắc phục nhược điểm trên, người ta đã sử dụng kỹ thuật sắc ký pha liên kết (Bonded - Phase Chromatography - BPC). Trong kỹ thuật này, pha tĩnh được liên kết hóa học với chất mang. Kỹ thuật này đã nhanh chóng trở thành kỹ thuật phổ biến nhất trong HPLC. Trong loại pha tĩnh này, các nhóm chức hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua các nhóm silanol. Tính phân cực của loại pha tĩnh này phụ thuộc chủ yếu vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết, chúng ở trong vùng từ nhóm khơng phân cực octadecyl silan đến nhóm phân cực nitril.
Dưới đây là một số pha liên kết thường dùng:
Octyl = Si-(CH2)7-CH3 C8
Octadecyl = Si-(CH2)17-CH3 C18
Phenyl = Si-(CH2)n-C6H5 C6H5
Cyanopropyl = Si-(CH2)3-CN CN
Aminopropyl = Si-(CH2)3-NH2 NH2
Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực được gọi là sắc ký pha thuận. Ngược lại, pha động phân cực cịn pha tĩnh khơng phân cực được gọi là sắc ký pha đảo.
- Khi sử dụng silica, nhơm oxit hoặc polymer xốp thì các chất được phân tách theo cơ chế hấp phụ nên được gọi là sắc ký hấp phụ.
- Nếu pha tĩnh là nhựa trao đổi ion thì gọi là sắc ký trao đổi ion. - Nếu pha tĩnh là polymer xốp như dextran,… thì ta có sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử - Size Exclution Chromatography).
+ Pha động: Ái lực của một thành phần đối với pha tĩnh hay nói một cách khác, thời gian lưu giữ của nó trên cột được điều khiển bằng cách thay đổi độ phân cực của pha động. Pha động có thể là dung mơi đơn hay hỗn hợp của 2, 3 hay 4 thành phần. Người ta có thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ của các thành phần dung môi trong hỗn hợp. Kỹ thuật thay đổi liên tục thành phần dung môi trong thời gian chạy sắc ký được gọi là rửa giải gradient hoặc chương trình hóa dung mơi.
Tùy thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại (sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo):
+ Sắc ký pha thuận (normal phase): Trong kỹ thuật này người ta sử dụng chất nạp cột (packings) gồm các nhóm phân cực liên kết với chất mang như nhóm alkylnitril [-(CH2)nCN] và alkylamin [-(CH2)nNH2]. Dung mơi sử dụng là dung môi của sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng – rắn - LSC). Kỹ thuật này, sử dụng pha tĩnh phân cực hơn pha động, được gọi là sắc ký phân bố pha thuận. Sự phân tách đạt được bằng sắc ký pha thuận cũng tương tự ở LSC. Song pha tĩnh trong sắc ký pha liên kết có ưu điểm hơn pha tĩnh trong LSC như:
- Cột nhanh đạt cân bằng nên rất thuận lợi cho phân tách gradient. - Cột thích hợp với nhiều dung mơi và dễ tái sinh.
- Cột rất bền.
- Cột alkylamin có thể có chức năng như một cột trao đổi anion yếu. Pha động trong sắc ký pha thuận nói chung khơng phân cực, thường dùng hỗn hợp của các hydrocarbon mạch thẳng như pentan, hexan, heptan,
isooctan. Các dẫn chất halogen dãy béo cũng có thể được sử dụng như: diclorometan, dicloroetan, butylclorid và cloroform. Có thể thêm vào các pha khan nước này 1-2% acid acetic hoặc phosphoric để ngăn cản sự ion hóa của các chất như: các phenol hoặc acid carboxylic. Ngược lại, sự ion hóa của các base yếu có thể được kìm lại bằng cách thêm một lượng nhỏ amoniac hoặc một amin khác (0,1-1%). Ngồi ra cũng có thể thêm vào pha động những chất hữu cơ khác như alcohol. tetrahydrofuran.
Nói chung, việc đuổi khí hịa tan khơng thành vấn đề với dung môi pha thuận.
Trong sắc ký pha thuận các chất không phân cực sẽ được rửa giải sớm. Thứ tự rửa giải sẽ chậm dần theo chiều tăng của độ phân cực của các thành phần trong mẫu thử.
Sắc ký pha đảo:
Trong kỹ thuật này pha tĩnh bao gồm các nhóm khơng phân cực như octadecyl(C18), octyl (C8) hay phenyl (C6H5). Pha động là những dung môi phân cực như: nước, methanol (MeOH), aetonitril (ACN). Tóm lại, pha động phân cực hơn pha tĩnh.
Độ chọn lọc của kỹ thuật này khác biệt đáng kể so với quá trình tách trên pha thuận. Người ta thấy rằng, một chất càng tan tốt trong nước thì nó rửa giải khỏi cột càng nhanh. Quy tắc rửa giải này ngược với pha thuận.
Với các chất được rửa giải quá sớm trong sắc ký pha thuận, chúng sẽ rất khó tách rời nhau. Trong khi đó, ở pha đảo, các thành phần này sẽ được rửa giải vào gần cuối của quá trình sắc ký làm cho việc tách dễ dàng hơn.
Thành phần đầu tiên của pha động trong sắc ký pha đảo là nước. Những dung mơi hịa lẫn được với nước như methanol, ethanol, acetonnitril, dioxan, tetrahydrofuran và dimethylformamid được thêm vào để điều chỉnh độ phân cực của pha động. Một số thành phần khác cũng có thể được thêm vào pha động như: các acid, base, đệm.
Cặp dung môi được sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký pha đảo là: H2O - MeOH và H2O-ACN. Điều dễ nhận thấy, MeOH có nhược điểm là độ nhớt cao của nó có thể làm giảm hiệu lực cột. Trong khi CAN có độ nhớt thấp hơn, thích hợp hơn với các chất khơng phân cực vì thế nó
thường được dùng nhiều hơn MeOH. Thời gian lưu sẽ ngắn hơn nếu nồng độ CAN bằng nồng độ MeOH.
Chú ý: Khi pha động có thêm các muối vơ cơ hoặc các chất hoạt
động bề mặt, nên lọc nó trước khi dùng vì có thể có cặn khơng tan trong nước gây bẩn cột.
Việc đuổi khí rất quan trọng với pha động pha đảo.
Về thứ tự rửa giải: Trong sắc ký pha đảo các chất phân cực ra trước,
các chất ít và khơng phân cực ra sau.
Sắc ký cặp ion (Ion-Pair Chromatography IPC)
Sắc ký cặp ion dựa trên cơ sở sự tạo thành cặp từ ion cần phân tích mang điện và tác nhân tạo cặp mang điện trái dấu (đối ion).
Xn-+Qn+ =[ ]XQ hc
Nhìn chung, IPC thực chất là HPLC pha đảo.
Dung mơi: Chính là dung mơi trong pha đảo, thường phối hợp H2O- MeOH và H2O-CAN. Điểm quan trọng nhất là phải đảm bảo rằng thuốc thử tạo cặp ion đã tan hết trong pha động để tránh kết tủa trong hệ thống.
Đối ion: Đối ion thường là các amin bậc 4 hoặc các muối sulfonat.
Cần phải điều chỉnh pH của pha động với đệm tới giá trị thích hợp. Đồng thời phải kiểm tra độ tan của đệm trong dung môi trước khi bơm qua hệ sắc ký.
Cột: Dùng các chất nạp pha đảo với các nhóm alkyl C2, C8 và C 18,… Ví dụ: Tách hỗn hợp vitamin trong nước bằng HPLC cặp ion pha đảo.
Điều kiện sắc ký:
- Mẫu thử: vitamin tan trong nước - Cột: Zorbax SBC, 4,6 x 150mm, 5μm.
- Pha động: ACN/MeOH/diethylamin 2%/acid acetic 2% (2/3/4/28) và 1,1g Na heptan sulfonat/lit
- Đầu dò - Detector: UV 280nm
Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (Liquid – Solid Chromatography LSC):
Là kỹ thuật phát triển sớm nhất và được dùng phổ biến nhất. Trong kỹ thuật này, chất cần phân tích bị giữ trên bề mặt pha tĩnh (chất hấp phụ) và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ).
Pha tĩnh có thể là silicagel, nhơm oxyde,… nhưng silicagel được dùng nhiều hơn. Pha động thường là những dung mơi ít hoặc khơng phân cực. Khi rửa giải, các chất không phân cực sẽ ra trước, các chất càng phân cực càng ra chậm.
Sắc ký trao đổi ion (Ion – Exchange Chromatography IEC):
Sắc ký trao đổi ion được dùng để phân tách các thành phần ion hóa tan trong nước, có phân tử lượng nhỏ hơn 1500. Pha tĩnh là các nhựa trao đổi ion dưới dạng bột mịn. Đó là những hợp chất cao phân tử có chứa nhóm chức có khả năng trao đổi.
- Nhựa có nhóm hoạt động mang điện tích âm, dùng để tách các chất base như các amin.
- Nhựa có nhóm hoạt động tích điện dương để phân tách các chất mang điện âm, như các nhóm phosphate, sulfonat, carboxylat.
pH của pha động, nhiệt độ, loại ion, nồng độ ion có ảnh hưởng đến cân bằng nhưng có thể điều chỉnh để thu được kết quả tách mong muốn.
Sắc ký loại cỡ (Size Exclusion Chratomatography SEC):
Phương pháp SEC được ứng dụng chủ yếu để phân tách các chất hữu cơ có phân tử lượng (MW) lớn hơn 2000. Pha tĩnh là những hạt xốp của silica gel hay polymer.
Khi sắc ký, các phân tử của các chất cần phân tích được lọc theo loại cỡ của khối lượng phân tử. Khi cho hỗn hợp cần phân tách qua cột, ta thấy:
- Các phân tử có MW quá lớn, chạy nhanh qua cột, chúng không bị lưu giữ.
chúng sẽ lần lượt ra khỏi cột với thời gian lưu tăng theo chiều giảm của khối lượng phân tử.