Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.7. Phát hiện ADN HPV trong mô
+ Kỹ thuật PCR
PCR (polymerase chain reaction) đƣợc phát triển vào giữa những năm 1980 và đã đƣa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là phƣơng pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích gen và hệ gen. Kh khăn lớn nhất trƣớc đây trong việc phân tích gen là ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp khổng lồ. Chẳng hạn hệ gen của động vật bậc cao chứa tới 100.000 gen. Kỹ thuật PCR ra đời
đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ra một số lƣợng lớn các bản sao của đoạn ADN mong muốn.
PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép ADN với sự tham gia của một loại enzym ADN- polymerase chịu nhiệt, c 2 đoạn ngắn ADN một sợi làm mồi và dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Vì vậy, để khởi đầu quá trình tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (c độ dài từ 6-30 nucleotid). Đoạn này gắn kết với ADN khuôn tại thời điểm khởi đầu sao chép và đƣợc ADN - polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADN đặc thù. Các sợi ADN mạch đơn làm khuôn đƣợc tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 90o
C (92- 98o C) mà thƣờng là 94o
C cho chuỗi xoắn kép ADN bung ra.
Cả 2 sợi ADN đều đƣợc dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi (gọi là oligonucleotit hay primer) đƣợc cung cấp để bám vào vị trí tƣơng ứng cho cả 2 sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đƣợc chọn nằm ở 2 đầu đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới đƣợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này. Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotit. Nhƣ vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới đƣợc tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại đƣợc nâng nhiệt độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đ đƣợc dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bƣớc: gắn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý thuyết, ta sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép . Nhƣ vậy,
kết quả là một đoạn ADN định trƣớc đƣợc “nhân lên” với một lƣợng rất lớn. Ví dụ, sau 30 chu kỳ số lƣợng bản sao ADN của PCR sẽ là 1.073.741.824.
Do c độ chính xác cao trong nghiên cứu sinh học phân tử, nên kỹ thuật PCR đƣợc nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh về Virus, Vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất tin cậy. Mặt khác, sự phân tích thành phần và trật tự nucleotit trên phân tử ADN trong hệ gen cịn có giá trị rất lớn trong phân loại các loài sinh vật. Chính nhờ tính thực tiễn to lớn của kỹ thuật này mà tác giả của PCR, Kary Mullis đã đƣợc tặng giải thƣởng Nobel vào năm 1993 [32].
+ Nested - PCR (PCR lồng)
Kỹ thuật nested - PCR nhân đoạn gen đƣợc thực hiện hai lần liên tiếp, sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất làm mẫu (template) cho phản ứng PCR thứ hai. Đoạn gen đƣợc tổng hợp lần thứ hai nằm trong đoạn gen thứ nhất và ngắn hơn so với đoạn gen đã tổng hợp ở phản ứng PCR thứ nhất.
Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR lồng (nested - PCR)
- Sau chu kỳ đầu tiên biến tính ADN ở nhiệt độ 95o C trong 5 phút thì - Thực hiện chu trình gồm 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ 3 bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1: Duỗi xoắn ADN cƣỡng bức ở 94o
C trong 30 giây. Bƣớc 2: Hạ nhiệt độ xuống 58o
C trong 40 giây để gắn mồi vào gen đích.
Bƣớc 3: Nâng nhiệt độ lên 72o
C trong 45 giây để Taq ADN - polymerase xúc tác phản ứng nối dài primer theo nguyên lý bổ sung với gen đích của HPV để tổng hợp nên đoạn ADN mới giống hệt đoạn ADN của gen đích ban đầu.
- Điện di sản phẩm PCR trên Agarose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và đọc trên máy đọc Gel – Doc [33].
+ Kỹ thuật Realtime-PCR
Kỹ thuật realtime PCR là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng để khuếch đại phân tử ADN in vitro. Tuy nhiên, Realtime PCR khác phản ứng PCR thơng thƣờng ở chỗ nó có khả năng phát hiện và định lƣợng trực tiếp sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ của phản ứng. Phƣơng pháp này đòi hỏi một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cƣờng độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu và đƣợc trang bị chƣơng trình phần mềm cho phép xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cƣờng độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại.
Nguyên lý của kỹ thuật Realtime PCR: Phản ứng Realtime PCR đƣợc thực hiện trong một máy gia nhiệt có khả năng chiếu sáng mỗi một mẫu với một chùm ánh sáng có chiều dài bƣớc sóng nhất định. Ngồi ra máy PCR này cịn xác định đƣợc bƣớc sóng ánh sáng phát ra từ phân tử phát huỳnh quang bị kích hoạt trong ống PCR. Từ đ máy c thể xác định đƣợc tín hiệu huỳnh quang thay đổi sau mỗi chu kỳ do số lƣợng phân tử ADN đƣợc tổng hợp tăng lên. Vì vậy có thể tính đƣợc lƣợng sản phẩm ADN thu đƣợc sau phản ứng.
Nhƣ vậy quy trình thực hiện kỹ thuật realtime PCR cũng theo nguyên tắc thông thƣờng của phản ứng tổng hợp chuỗi. Tuy nhiên, đặc điểm khác biệt chính là đoạn DNA đƣợc nhân lên sẽ đƣợc phát hiện tại mỗi thời điểm diễn ra phản ứng (realtime). Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận hoặc nghịch với số đoạn DNA tạo thành.
Hoá chất và thuốc thử trong kỹ thuật realtime PCR: Chìa khố kỹ thuật chính trong kỹ thuật realtime PCR chính là chất phát huỳnh quang. Nó sẽ phát huỳnh quang hoặc khơng phát quang khi có sự hiện diện của sản phẩm khếch đại từ DNA đích.
Chất huỳnh quang: màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA c ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA và ái lực này làm cho sợi đôi phát đƣợc ánh sáng huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích. Do đ , máy sẽ xác định đƣợc cƣờng độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tăng lên sau mỗi chu kỳ phản ứng.
Đầu dò phát huỳnh quang (Probe): là những đoạn oligonucleotide sợi đơn c trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích. Đầu dị oligonucleotide này đƣợc gắn các phân tử có thể phát huỳnh quang. Sự phát quang này thơng thƣờng xuất hiện khi có mặt sự kết cặp của đầu dị (probe) với phân tử ADN đích. Vì vậy cƣờng độ phát quang sẽ thay đổi sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR. Qua đ máy Realtime giúp định lƣợng đƣợc số bản sao đƣợc nhân lên tại mỗi thời điểm. Ngồi ra cịn nhiều cơ chế phát quang đƣợc các nhà nghiên cứu phát triển nữa. Nhƣng nhìn chung đều dựa vào sự thay đổi cƣờng độ huỳnh quang sau mỗi chu kỳ phản ứng, do phân tử ADN đích đƣợc tạo ra nhiều hơn.
Có rất nhiều ứng dụng của kỹ thuật realtime PCR trong các phịng thí nghiệm. Kỹ thuật này đƣợc sử dụng phổ biến trong cả chẩn đoán và nghiên cứu cơ bản. Trong công nghiệp, kỹ thuật này đƣợc sử dụng để định lƣợng các vi sinh vật có trong thức ăn và rau, hoặc sử dụng để xác định các sinh vật biến đổi gen và định lƣợng xác định kiểu gen các virut gây bệnh ở ngƣời. Real time PCR đƣợc sử dụng trong việc phát hiện nhanh các axit nucleic có ý nghĩa chẩn đoán nhƣ xét nghiệm viêm gan C (HCV), viêm gan B (HBV), xét nghiệm HIV, ung thƣ, và có thể cả bất thƣờng di truyền…[34].
+ Kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing).
Giải trình tự gen (ADN sequencing) là phƣơng pháp xác định trình tự sắp xếp các nucleotid trong phân tử ADN. Nguyên lý của phƣơng pháp này là: tổng hợp các mạch đơn ADN mới c độ dài ngắn hơn mạch khuôn, nhờ kỹ
thuật đánh dấu và ngắt đoạn trong quá trình tổng hợp mạch ADN nên thu đƣợc các mạch đơn hơn kém nhau một base, từ đ c đƣợc sơ đồ trật tự mạch ADN khuôn mẫu. So sánh trật tự mạch của mẫu thí nghiệm với trình tự ADN chuẩn ta biết đƣợc các loài, chủng hoặc kiểu gen khác nhau cũng nhƣ phân tích các đột biến có thể xảy ra. Kỹ thuật giải trịnh tự gen c ý nghĩa ngồi hỗ trợ chẩn đốn chính xác sản phẩm PCR của đoạn gen đích c chính xác là HPV hay khơng, mà cịn là kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến để phân tích kiểu gen và dƣới kiểu gen của HPV [35].
+ Kỹ thuật BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
Công cụ BLAST (Trung tâm Quốc gia về Thông tin công nghệ sinh học Hoa Kỳ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) sẽ lắp ghép trình tự của các nucleotid trong phân tử ADN của HPV với hàng triệu chuỗi đƣợc lƣu trữ trong các cơ sở dữ liệu genomic và nucleotide của ngân hàng gen (Genbank). Cơng cụ này cho kết quả là các trình tự tƣơng tự, giống nhau hoặc gần giống nhất so với trình tự thu đƣợc sau giải trình tự gen. Kỹ thuật BLAST cũng cung cấp những hiểu biết chuyên sâu để có thể nhận dạng của các chuỗi đ . Kết quả bao gồm sự tƣơng đồng giữa các lồi đã biết có trên ngân hàng gen so với trình tự gen đích cần nghiên cứu. Cơng cụ Blast rất quan trọng vì nó giúp xác nhận rằng các trình tự tƣơng đồng và không phải là liên kết ngẫu nhiên giữa các loài với nhau [36].
+ Kỹ thuật phân tích lồi (Phylogenetic Analysis) và dựng cây phân loài (Phylogenetic tree analysis) [37]
Các phƣơng pháp dùng để nghiên cứu phát sinh loài chủ yếu dựa trên một sự giả định về các tiến trình tiến hóa ở mức phân tử thơng qua việc quan sát phân tích trình tự ADN thu đƣợc. Bằng cách sử dụng phần mềm phân tích lồi chun biệt, các chuỗi dữ liệu (ADN, ARN) sẽ đƣợc mơ phỏng tiến trình tiến hóa và phân tích tiến trình phát sinh của loài. Tùy thuộc nhiều vấn đề mà
các bƣớc của một nghiên cứu phát sinh lồi có thể thiết lập khác nhau, nhƣng cơ bản nó gồm các bƣớc sau:
. Xác định mục tiêu, lấy mẫu sinh vật và họ gene
. Chọn marker phân tử, tức gene hay protein cần đọc trình tự . Đọc trình tự gen (protein): hiệu chỉnh trình tự
. Sắp xếp thẳng hàng các trình tự gen (protein) . Chọn mơ hình tiến hóa phân tích phát sinh lồi . Phân tích sự phát sinh lồi
. Đọc cây tiến hóa phát sinh lồi . Kiểm tra cây tiến hóa
. Chấp nhận kết quả hoặc quay lại bƣớc 2