2.2.1 .Tiêu chuẩn chẩn đoá nu nhú đảo ngƣợc mũi xoang
2.2.5. Trang bị, hóa chất nghiên cứu
2.2.5.1. Trang thiết bị nghiên cứu
- Bộ dụng cụ khám tai mũi họng thơng thƣờng, kìm bấm sinh thiết. - Bộ nội soi ph ng đại ống cứng 0o, 30o, 70o và các thiết bị kèm theo (nguồn sáng, dây dẫn, màn hình, camera, chụp ảnh).
- Máy Real-time PCR (IQ5) của hãng BioRad - Máy PCR Light cycler 96 của Roche Diagnostics. - Máy giải trình tự gen tự động ABI 3130XL.
- Máy soi gel tia UV-VIS của BioRad.
- Máy Nano Drop ND-1000 (Thermo-Scientific, USA). - Máy khuấy từ gia nhiệt IKA (Đức).
- Máy ly tâm.
- Máy lắc ổn nhiệt 37oC. - Lị vi sóng (Sharp).
- Bộ điện di ADN và nguồn điện điện di Scieplar (Bio - Rad). - Máy soi thạch và chụp ảnh tự động (Gel - Doc).
- Pipet các loại và các dụng cụ thủy tinh khác.
Hình 2.1. Máy NanoDrop 1000, Thermo Scientific, Hoa Kỳ. - Dao cắt mẫu - Dao cắt mẫu
- Micropipet
- Bộ đĩa thủy tinh để cắt mẫu
Dụng cụ phải đƣợc vô trùng tuyệt đối (hấp sấy vô trùng).
Hình 2.2. Máy Realtime-PCR IQ5 của Hãng Bio-RAD (Hoa Kỳ)
2.2.5.1. V t liệu và hóa ch t nghiên cứu
- Agarose, enzyme Proteinase K (hãng Sigma, Hoa Kỳ). - Cột lọc
- Giấy parafin
- Bộ kít tách ADN tổng số từ mô sinh thiết (Qiamp ADN Mini Kit, Hãng QIAGEN Cộng hòa Liên bang Đức).
- Kít tách ADN tổng số từ mơ vùi parafin (MagMax FFPE DNA Ultra kit, HãngThermo Scientific (Hoa Kỳ).
- Các hóa chất dùng trong phản ứng nested-PCR và real time nested- PCR SYBR, real time PCR Taqman probe để nhân bản đoạn gen đặc hiệu cho HPV và gen b-actin bao gồm: PCR nTaq Hot, TOPreal™ qPCR 2X PreMIX (SYBR Green), TOPreal™ qPCR 2XPreMIX (TaqMan Probe), đều mua của hãng Enzynomics, Hàn Quốc.
- Đối chứng dƣơng của phản ứng PCR/ real time nested PCR là hỗn hợp các mẫu ADN tinh sạch từ mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với HPV genotype 6 và 11 và đối chứng âm là ADN tinh sạch từ mẫu bệnh phẩm âm tính với HPV do bệnh viện Da liễu trung ƣơng cung cấp đƣợc xác định đồng thời bằng bộ kit GF test (Diagcor, Hồng Kong) và HPV 6/11 Real-TM kit (Saccase- Ý).
- Cặp mồi: GP5+/ GP6+ và GP7/ GP8 đƣợc sử dụng theo trình tự đã đƣợc cơng bố trƣớc đây, và đƣợc đặt tổng hợp bởi IDT (Hoa Kỳ) [56].
Bảng 2.1. Các cặp mồi dung trong phản ứng nested- PCR Vùng Vùng
gene Tên mồi Trình tự mồi (5’- 3’)
Kích thƣớc (bp) LP1 GP7 (F) GP8 (R) TTTAATAARCCATATTGGYTRCA‟ ATTCATAGTATGWATATAKGYCAT‟ 270 LP1 GP5+ (F) GP6+ (R) TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC‟ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 140-150 Các hóa chất này đƣợc bảo quản và sử dụng theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.