Các thông số nghiên cứu

2.2.1 .Tiêu chuẩn chẩn đoá nu nhú đảo ngƣợc mũi xoang

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.2. Các thông số nghiên cứu

Nhóm u nhú đảo ngƣợc mũi xoang

- Tuổi, giới.

- Tiền sử bệnh: dị ứng, tái phát, bệnh mũi xoang - Thói quen (uống rƣợu, hút thuốc lá).

- Các đặc điểm lâm sàng.

- Nội soi mũi xoang, CT scan, chẩn đoán giai đoạn bệnh. - Đặc điểm giải phẫu bệnh.

- Các đặc điểm nhiễm HPV: có/khơng nhiễm HPV (Real time SYBR PCR, nested PCR), kiểu gen HPV (giải trình tự gen, dựng cây phân lồi).

- Mối liên quan đặc điểm lâm sàng, nội soi… với HPV.

Nhóm polyp mũi xoang

Các đặc điểm nhiễm HPV: có/khơng nhiễm HPV (Real time SYBR PCR, nested PCR), kiểu gen HPV (giải trình tự gen, dựng cây phân lồi).

Nhóm ung thƣ mũi xoang

Các đặc điểm nhiễm HPV: có/khơng nhiễm HPV (Real time SYBR PCR, nested PCR), kiểu gen HPV (giải trình tự gen, dựng cây phân loài)2.3.3. Các phƣơng pháp tiến hành

2.3.3.1. P ơ á ứu âm

- Mỗi bệnh nhân đƣợc đăng ký theo dõi vào phiếu theo dõi đã đƣợc xây dựng c đầy đủ các chỉ tiêu về dịch tễ, lâm sàng và xét nghiệm.

Đối với bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc mũi xoang : Tất cả các bệnh nhân đều đƣợc chụp CT scan để đánh giá vị trí và mức độ xâm lấn khối u mũi xoang với tổ chức xung quanh và để c hƣớng phẫu thuật thích hợp. Cũng nhƣ qua CT scan có thể phát hiện những cấu trúc giải phẫu dị dạng, bất thƣờng để tránh những biến chứng có thể xảy ra.

Chủ yếu dựa vào hình ảnh CT scan và biên bản phẫu thuật để chẩn đoán giai đoạn của u nhú đảo ngƣợc mũi xoang. Theo Krouse (2000): u nhú đảo ngƣợc mũi xoang chia làm bốn giai đoạn: [57]:

 T1: Khối u nằm trong hốc mũi, chƣa phát triển vào xoang; khơng có tổn thƣơng ác tính.

 T2: Khối u phát triển tới vùng phức hợp lỗ ngách và xoang sàng, hoặc thành trong xoang hàm; khơng có tổn thƣơng ác tính.

 T3: Khối u chiếm toàn bộ xoang hàm; hoặc lan vào xoang bƣớm; hoặc lan vào xoang trán; khơng có tổn thƣơng ác tính.

 T4: Khối u vƣợt khỏi phạm vi mũi xoang (xâm lấn ổ mắt, nội sọ, hố chân bƣớm hàm) hoặc có tổn thƣơng ác tính.

2.3.3.2. Xét nghiệm mơ bệnh h c

* Chẩn đốn mơ bệnh học đƣợc tiến hành theo các bƣớc:

- Lấy bệnh phẩm sau phẫu thuật u nhú đảo ngƣợc, polyp và khối u mũi xoang.

- Cố định bệnh phẩm bằng Bouin. - Khử nƣớc bằng cồn ethylic 70o-100o. - Khử cồn bằng dung dịch xylen. - Tẩm paraffin để khử xylen.

- Đúc bloc nến paraffin.

- Cắt mảnh bệnh phẩm paraffin.

- Dán mảnh cắt bệnh phẩm trên phiến kính. - Nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE).

- Đọc tiêu bản.

2.3.3.4 P ơ á c phân tử xá ịnh HPV-ADN và ki u gen HPV

Kỹ thuật lấy mẫu

Mô nghiên cứu đƣợc sinh thiết 3 mảnh trên mô u của mỗi bệnh nhân nhóm 1 và nhóm 2, cho vào ống Eppendorf 2 ml có nắp xốy, cho ngay vào tủ bảo quản ở - 80 0C đến khi sử dụng.

Nhóm 3 mẫu mơ ung thƣ mũi xoang đƣợc tách từ mẫu mơ đƣợc chẩn đốn xác định ung thƣ mũi xoang vùi trong parafin

Kỹ thuật tách và tinh sạch ADN từ mẫu mô sinh thiết

Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số từ mô sinh thiết sử dụng bộ kit Qiamp DNA Mini Kit (QIAGEN) theo qui trình hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Mẫu sau khi nghiền trong nitơ lỏng, hòa tan trong 200 ul PBS. Tiếp tục tách ADN tổng số theo qui trình gồm các bƣớc sau:

Bƣớc 1. Cho 20 l Protease K vào tube eppendorf 1,5 ml. Sau đ cho vào 200 l dung dịch mẫu đã nghiền trong PBS.

Bƣớc 2. Cho 200 l buffer AL vào mẫu sau đ lắc trộn trong 15 giây. Bƣớc 3. Ủ ở nhiệt độ 56 0

C trong 10 phút, ly tâm ngắn.

Bƣớc 4. Cho 200 l cồn tuyệt đối vào mẫu sau đ lắc trộn 15 giây, rồi ly tâm 15 giây.

Bƣớc 5. Chuyển toàn bộ sang cột lọc và đựng trong ống đi kèm (tube Qiamp spin column). Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch lọc và giữ lại cột.

Bƣớc 6. Cho 500 l Buffer AW1 để rửa cột. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút sau đ bỏ dịch lọc và giữ lại cột.

Bƣớc 7. Cho 500 l Buffer AW2. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút sau đ bỏ dịch lọc, giữ lại cột. Tiếp tục ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút.

Bƣớc 8. Chuyển cột sang một tube eppendorf 1.5 ml vô trùng. Sau đ thêm 200 l Buffer AE hoặc nƣớc cất khử ion. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút rồi ly tâm 8000 rpm trong 1 phút.

Bƣớc 9. ADN sau khi tách đƣợc đo nồng độ và đánh giá độ tinh sạch bằng máy Nano Drop ND-1000 (Thermo-Scientific, USA). Số đọc A260/A280 là tỉ lệ độ hấp thụ của mẫu ở hai bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Tỉ lệ này để đánh giá độ tinh sạch của ADN thu đƣợc. Tỉ lệ này nếu nằm trong khoảng 1,8- 2,2 thì mẫu ADN thu hồi đƣợc coi là tinh sạch.

Bƣớc 10. Thu ADN trong tube và bảo quản ở - 200

C.

Kỹ thuật tách và tinh sạch ADN từ mơ vùi parafin

- Hóa chất: Sử dụng bộ kít thƣơng mại MagMax FFPE DNA Ultra kit (Thermo Scientific, USA) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.

- Chuẩn bị RNase Solution: trƣớc tiên, chuẩn bị RNase Solution, bảo quản trên đá cho đến khi sử dụng: với tỷ lệ RNase A: Nuclease-Free Water là 1: 99 (thể tích RNase Solution cần dùng cho 1 phản ứng là 100 μl)

- Chuẩn bị mẫu

Bƣớc 1. Cắt 1 hoặc 2 miếng mẫu kích thƣớc khoảng 10 μm, chuyển sang các giếng thí nghiệm.

Bƣớc 2. 150 μl Digestion Buffer đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu và ngâm các mẫu ở trong đệm.

Bƣớc 3. 4 μl Proteinase K và 30 μl ADN Digestion Additive đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu.

Bƣớc 4. đĩa đƣợc che và ủ mẫu 60oC trong 60 phút, sau đ lên 80o

C trong 30 phút

Bƣớc 5. Trong thời gian ủ mẫu, chuẩn bị 620 μl Binding Solution cho mỗi phản ứng bao gồm 200 μl Binding Buffer và 420 μl isopropanol

Bƣớc 6. Sau khi ủ mẫu tại 80oC, thêm 620 μl Binding Solution vào mỗi giếng mẫu, spin đĩa mẫu trong 5 giây, ủ đĩa tại nhiệt độ phòng trong 5 phút

- Gắn ADN với Nucleic Acid Binding Beads

Bƣớc 1. 20 μl Nucleic Acid Binding Beads đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu, sau đ lắc trong 3 phút với tốc độ 3-4, mix các giếng mẫu cẩn thận bằng pipet 10-12 lần.

Bƣớc 2. Đĩa mẫu đƣợc đặt lên đế từ 96 trong 3-5 phút hoặc cho đến khi dung dịch sạch.

Bƣớc 3. Phần dịch nổi đƣợc hút bỏ nhẹ nhàng.

- Rửa Nucleic Acid Binding Beads

Bƣớc 1. Đĩa mẫu đƣợc nhấc ra khỏi đế từ 96, 150 μl Wash Solution 1 đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu.

Bƣớc 2. Đĩa mẫu đƣợc che và lắc với tốc độ 8 trong 1 phút.

Bƣớc 3. Đĩa mẫu đƣợc đặt lên đế từ 96 trong 1-2 phút hoặc đến khi dung dịch sạch.

Bƣớc 4. Phần dịch nổi đƣợc hút bỏ nhẹ nhàng.

Bƣớc 5. Đĩa mẫu đƣợc nhấc ra khỏi đế từ 96, 150 μl Wash Solution 2 đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu.

Lặp lại Bƣớc 2, 3, 4

Bƣớc 6. Không che đĩa mẫu và lắc trong 2 phút tại tốc độ 9 để làm khô Nucleic Acid Binding Beads.

- Xử lý Rnase A

Bƣớc 1. 100 μl Rnase Solution đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu, sau đ lắc trong 2 phút với tốc độ 8.

Bƣớc 2. Đĩa mẫu đƣợc che và ủ tại nhiệt độ 37o

C trong 20 phút. Bƣớc 3. Đĩa mẫu đƣợc lắc trong 5-10 phút với tốc độ 8.

Bƣớc 4. Rebinding Solution đƣợc chuẩn bị bao gồm 100 μl Rebinding Buffer và 200 μl Isopropanol cho mỗi phản ứng.

Bƣớc 5. 300 μL Rebinding Solution đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu sau đ lắc 3 phút.

Bƣớc 6. Đĩa mẫu đƣợc đặt lên đế từ 96 trong 3-4 phút hoặc để đến khi dung dịch sạch

Bƣớc 7. Dịch nổi đƣợc hút loại bỏ.

- Rửa và chiết đẩy mẫu

Bƣớc 1. Đĩa mẫu đƣợc nhấc ra khỏi đế từ 96, 150 μl Wash Solution 2 đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu, đĩa mẫu đƣợc che và lắc trong 1 phút.

Bƣớc 2. Đĩa mẫu đƣợc đặt lên đế từ 96 trong 1-2 phút hoặc đến khi dung dịch sạch

Bƣớc 3. Dịch nổi đƣợc hút bỏ nhẹ nhàng.

Bƣớc 4. Đĩa mẫu không che và lắc để làm khô mẫu.

Bƣớc 5. 70 μl Elution Buffer đƣợc thêm vào, đĩa đƣợc che lại và lắc trong 1 phút.

Bƣớc 6. Đĩa mẫu đƣợc ủ và lắc trong 4 phút tại 80o

C.

Bƣớc 7. Đĩa mẫu đƣợc đặt lên đế từ 96 trong 3-4 phút hoặc đến khi dung dịch sạch.

ADN sau khi tách, đƣợc đo nồng độ và đánh giá độ tinh sạch bằng máy Nano Drop ND-1000 (Đã mô tả ở mục 2.3.4.3). Số đọc A260/A280 là tỉ lệ độ hấp thụ nằm trong khoảng 1,8- 2,2 thì mẫu ADN thu hồi đƣợc coi là tinh sạch.

Phản ứng PCR vòng 1 khuếch đại vùng gen L1 HPV sử dụng cặp mồi GP7/ GP8

Áp dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu theo nhóm (Group- specific PCR) phát hiện nhiều genotype HPV cùng một nhóm sử dụng cặp mồi suy biến GP7/ GP8 [56], DNA tinh sạch từ mẫu mô đƣợc sử dụng làm khn cho phản ứng PCR vịng 1 khuếch đại đoạn gen đích c kích thƣớc 270 bp nằm trên gen L1 của HPV. Thành phần phản ứng PCR vòng 1 gồm: 10X nTaq Hot Buffer, dNTPs (2 mM), primer GP7/ GP8 (10 pmol), nTaq Hot (1 Unit), ADN, nƣớc cất khử trùng/ khử ion cho 20 µl tổng thể tích phản ứng. Phản ứng đƣợc thực hiện với chu trình luân nhiệt nhƣ sau:

- 01 chu kỳ biến tính ADN và hoạt hố Hot-Taq ở nhiệt độ 95o C trong 10 phút

- 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1. 94o C trong 30 giây. Bƣớc 2. 58o C trong 40 giây Bƣớc 3. 72o C trong 45 giây . - Cuối cùng duy trì trong 7 phút.

Real-time nested PCR SYBR vòng 2 phát hiện HPV sử dụng cặp mồi GP5+/ GP6+

Để hạn chế việc thao tác điện di kiểm tra kết quả khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của HPV, là nguyên nhân dẫn đến phản ứng nhiễm chéo (carrier- over) của sản phẩm PCR vào mastermix gây hiện tƣợng dƣơng tính giả, kỹ thuật real time nested-PCR SYBR 2 sử dụng mồi đặc hiệu GP5+/ GP6+

khuếch đại đoạn gen đặc hiệu trên gen LP1 của HPV đƣợc áp dụng [56]. 5 µl sản phẩm PCR vịng 1 đã pha lỗng 20 lần đƣợc sử dụng làm khn cho phản ứng real time nested PCR SYBR với thành phần phản ứng đƣợc mô tả trong Bảng 2.2 và chu trình nhiệt của phản ứng nhƣ sau:

- 01 chu kỳ biến tính ADN ở nhiệt độ 95o C trong 5 phút - 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ sau:

Bƣớc 1. 94o C trong 30 giây. Bƣớc 2. 58o C trong 40 giây Bƣớc 3. 72o C trong 45 giây . - Cuối cùng duy trì trong 7 phút.

Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm IQ5 Optical System (Bio - Rad) dựa vào chu kỳ ngƣỡng Ct (chu kỳ mà đầu đọc real time của máy bắt đầu ghi nhận đƣợc c tín hiệu huỳnh quang trong ống phản ứng) và chứng âm, chứng dƣơng (Sử dụng plasmid chứa đoạn gen đích của HPV).

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng Real time nested PCR phát hiện HPV Thành phần Thể tích Thành phần Thể tích

ToprealTM qPCR 2X PreMIX

(SYBR Green with low ROX) 10 µl

GP5+F (10 pmol) 1 µl

GP6+R (10 pmol) 1 µl

H2O cất khử trùng, khử ion 3 µl

ADN khn 5 µl

TỔNG 20 µl

Vì chất nhuộm huỳnh quang SYBR có khả năng phát quang khi gắn lên bất kỳ sợi đôi DNA nào, kỹ thuật này không cho phép phát hiện đồng thời cả

gen đích và gen nội chuẩn trong cùng 1 ống phản ứng (SYBR sẽ bám vào sản phẩm PCR của gen nội chuẩn và cũng cho tín hiệu huỳnh quang ở cả mẫu âm tính). Vì vậy, các mẫu DNA đều đƣợc kiểm soát chất lƣợng bằng cách tiến hành song song phản ứng real time PCR phát hiện đoạn gen 115 bp đặc hiệu cho gen giữ nhà β-globin, sử dụng TOPreal Taqman probe mastermix bổ sung

mồi xuôi β-globin Fw (5 pmol/pứ)

5‟-TTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3‟, mồi ngƣợc β-globin Rv (5 pmol/pứ) 5‟-CAACTTCATCCACGTTCACC, và β-globin probe (1 pmol/pứ) HEX-CTCCTGAGGAGAAGTC-MGB [58], đã đƣợc mô tả chi tiết trong công bố gần đây của chúng tơi [59].

Chu trình nhiệt của phản ứng nhƣ sau:

- 01 chu kỳ biến tính ADN và hoạt hố hot Taq ở nhiệt độ 95o C trong 10 phút

- 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 2 bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1. 95o

C trong 10 giây. Bƣớc 2. 60o

C trong 1 phút

Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp (sequencing)

Giải trình tự gen trực tiếp (Derect sequencing) là phƣơng pháp xác định trình tự sắp xếp các nucleotid trong phân tử ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR. Nguyên lý của phƣơng pháp này là: tổng hợp các mạch đơn ADN mới c độ dài ngắn hơn mạch khuôn; nhờ các ddNTPs đƣợc đánh dấu huỳnh quang và dừng ngẫu nhiên quá trình tổng hợp chuỗi để tạo các mạch đơn hơn kém nhau một base; từ đ c đƣợc sơ đồ trật tự mạch ADN khuôn mẫu. So sánh trật tự mạch của mẫu thí nghiệm với trình tự ADN chuẩn ta biết đƣợc các loài, chủng hoặc kiểu gen khác nhau cũng nhƣ phân tích các đột biến có thể xảy ra. giải trình tự gen đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Sanger.

Xác định kiểu gen của HPV trên các mẫu HPV dƣơng tính (chẩn đốn bằng kỹ thuật real time nested-PCR SYBR) đƣợc thực hiện bằng kỹ thuật

nested-PCR vòng 2 với thành phần mastermix và chu trình nhiệt tƣơng tự real time nested-PCR nhƣng không bổ sung SYBR để đảm bảo kết quả giải trình tự thu đƣợc phổ trình tự gen với các peak đẹp. Một số mẫu HPV âm tính đƣợc chạy song song cùng mẫu dƣơng tính để kiểm soát kỹ thuật. Sản phẩm PCR đƣợc giải trình tự gen theo nguyên lý Sanger sử dụng mồi GP5+ hoặc GP6+ đọc theo 2 chiều, đƣợc thực hiện bởi công ty IDT First-base sequencing qua dịch vụ của VNDAT. Kết quả giải trình tự đoạn gen đích L1 của HPV đƣợc phân tích và ghép nối bằng phần mềm ApE (v2.0.49.10).

2.3.3.5. P ơ á â xá ịnh ki u gen

- Phƣơng pháp xác định kiểu gen của HPV bằng so sánh Genbank (BLAST SEARCH):

Các trình tự đoạn gen L1 của các chủng HPV đƣợc căn chỉnh (aligment) bằng cách sử dụng CLUSTAL_W theo tác giả Thompson và cộng sự, (1994) [60] và BLAST (Trung tâm quốc gia về Thông tin công nghệ sinh học; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) trên ngân hàng gen (Blast search). Kiểu gen HPV đƣợc xác định bằng so sánh sự tƣơng đồng với các kiểu gen của HPV đã biết hiện có trên ngân hàng gen.

- Phƣơng pháp xác định kiểu gen của HPV bằng phƣơng pháp phân tích lồi (Phylogenetic Analysis) và dựng cây phân loài (Phylogenetic tree analysis):

Xác định kiểu gen HPV bằng phƣơng pháp phân tích nguồn gốc phát sinh di truyền và dựng cây phân loài (Phylogenetic Analysis and Genetic Tree): Các trình tự đoạn gen L1 của các chủng HPV đƣợc căn chỉnh (aligment) bằng cách sử dụng CLUSTAL_W (Thompson và cộng sự, 1994) [60] và BLAST. Độ chính xác của phƣơng pháp căn chỉnh chuổi gen (aligment) đƣợc kiểm tra thêm bằng cách sử dụng chƣơng trình BioEdit (Khoa Vi sinh, Bang Bắc Carolina Đại học, Raleigh, NC, Hoa Kỳ; http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Khoảng cách di truyền đƣợc

tính bằng cách sử dụng phƣơng pháp Kimura với hai tham số [61] và cây phát sinh loài đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbour-Joining [62]. Kết quả của cây phát sinh lồi đƣợc phân tích và hiển thị bằng cách sử dụng chƣơng trình MEGA7 [63] và phần mềm TreeView v.1.6.6 (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html). Các chuỗi gen HPV của các kiểu gen khác nhau từ GenBank đƣợc sử dụng làm trình tự gen tham chiếu cho các kiểu gen của HPV đã công bố trên ngân hàng gen, bao gồm các đại diện kiểu gen HPV-6, -11, -16, -18, -31, -33, -35, -45 -51, -55, -56, -58, -59.