4.3.2 .HPV liên quan với sự tái phát củ au nhú đảo ngƣợc mũi xoang
3.13: Kết quả điện di sản phẩm nested-PCR nhân bản HPV-ADN trong
Kết quả điện di sản phẩm nested PCR đều cho băng c kích thƣớc 150 bp duy nhất ở các mẫu dƣơng tính, các mẫu âm tính khơng thấy xuất hiện băng điện di. Kết quả này tƣơng thích với kết quả real time nested-PCR SYBR và đảm bảo chất lƣợng ADN khn cho việc giải trình tự gen đích.
Hình 3.14. Hình ảnh đại diện cho kết quả minh họa peak của một đoạn trình tự ADN vùng LP1 của HPV11 ở bệnh nhân Đỗ Văn T (BA.13.009205)
Kết quả trình tự tự động hiển thị trong hình thức của một sắc đồ. Các màu sắc đại diện cho bốn cơ sở: màu xanh là C, màu xanh lá cây là A, đen là G và màu đỏ là T.
Trong các mẫu u nhú đảo ngƣợc mũi xoang đƣợc phát hiện có mặt của HPV, kiểu gen HPV 11 đƣợc phát hiện bằng công cụ Blast Search. Kết quả giải trình tự cho thấy peak rõ nét, đảm bảo cho việc xác định kiểu gen HPV.
Bảng 3.10. Kết quả đối chiếu sự tƣơng đồng trình tự nucleotide với kiểu gen HPV11 của các chủng HPV ở mô u nhú đảo ngƣợc mũi xoang
Tên loại Virus có kết quả tƣơng đồng Giá trị Số Độ tƣơng đồng lớn nhất Tổng độ tƣơng đồng Độ bao phủ Tƣơng đồng Human papillomavirus
type 11 isolate 83A.11, complete genome 150 150 95% 97% KU298879.1 Human papillomavirus type 11 complete genome, isolate 30 150 150 95% 97% LN833190.1 Human papillomavirus type 11 complete genome, isolate 29 150 150 95% 97% LN833189.1 Human papillomavirus type 11 complete genome, isolate 28 150 150 95% 97% LN833188.1 Human papillomavirus type 11 complete genome, isolate 27 150 150 95% 97% LN833187.1 Nh n xét:
Sản phẩm cDNA của HPV đƣợc giải trình tự gen. Kết quả so sánh trình tự chuỗi nucleotit của đoạn gen L1 phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân Đỗ Văn T. trên ngân hàng gen sử dụng công cụ BLAST/Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/): kết quả giải trình tự đƣợc minh họa ở Hình 3.13. Qua kết quả đối chiếu với ngân hàng gen trên đây cho thấy kiểu gen của mẫu bệnh phẩm c sự phù hợp với chủng HPV 11 trên thế giới:
So với HPV kiểu gen 11 chủng 83A.11 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-97%. So với HPV kiểu gen 11 chủng 30 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-97%.
So với HPV kiểu gen 11 chủng 29 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-97%. So với HPV kiểu gen 11 chủng 28 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-97%. So với HPV kiểu gen 11 chủng 27 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-97%.
- Sự tương đồng trình tự nucleotide với của các chủng HPV phân lập ở mô UTMX so sánh trên ngân hàng gen:
Trên các mẫu bệnh phẩm UTMX phát hiện đƣợc HPV-ADN, có 2 kiểu gen HPV 11 và HPV 16 đƣợc phát hiện bằng công cụ Blast Search.
Bảng 3.11. Kết quả đối chiếu sự tƣơng đồng trình tự nucleotide với kiểu gen HPV16 của các chủng HPV phân lập ở mô ung thƣ mũi xoang
Tên loại Virus có kết quả tƣơng đồng Giá trị Số Độ tƣơng đồng lớn nhất Tổng độ tƣơng đồng Độ bao phủ Tƣơng đồng Human papillomavirus type 16 isolate 16CN47 major capsid protein L1 (L1) gene, complete cds
165 165 100% 97% KU951195.1
Human papillomavirus type 16 isolate 16CN46 major capsid protein L1 (L1) gene, complete cds
165 165 100% 97% KU951194.1
Human papillomavirus type 16 isolate 16CN45 major capsid protein L1 (L1) gene, complete cds
165 165 100% 97% KU951193.1
Human papillomavirus type 16 isolate 16CN44 major capsid protein L1 (L1) gene, complete cds
165 165 100% 97% KU951192.1
Human papillomavirus type 16 isolate 16CN42 major capsid protein L1 (L1) gene, complete cds
Nh n xét:
Kết quả so sánh trình tự chuỗi nucleotit của đoạn gen L1 phân lập từ bệnh phẩm số 20 trên ngân hàng gen sử dụng công cụ BLAST/Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Kết quả giải trình tự cho thấy peak rõ nét, đảm bảo cho việc xác định kiểu gen HPV bằng phần mềm BLAST.
Hình 3.15. Hình ảnh đại diện cho kết quả minh họa peak của một đoạn trình từ ADN vùng LP1 của HPV16 ở bệnh nhân ung thƣ mũi xoang Đặng Thị H.
(BA.14070.14)
Qua kết quả đối chiếu với ngân hàng gen trên đây cho thấy kiểu gen của mẫu bệnh phẩm c sự phù hợp với chủng HPV 16 trên thế giới:
So với HPV kiểu gen 16 chủng 16CN47 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-100%.
So với HPV kiểu gen 16 chủng 16CN46 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-100%.
So với HPV kiểu gen 16 chủng 16CN45 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-100%.
So với HPV kiểu gen 16 chủng 16CN44 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-100%.
So với HPV kiểu gen 16 chủng 16CN42 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-100%.
- Sự tương đồng trình tự nucleotide với của các chủng HPV phân lập ở mô bệnh nhân Polyp mũi xoang so sánh trên ngân hàng gen:
Hình 3.16. Hình ảnh đại diện cho kết quả minh họa peak của một đoạn trình tự ADN vùng LP1 của HPV11 ở bệnh nhân polyp mũi xoang Lý Thị H. (BA.
16.008006)
Kết quả so sánh trình tự chuỗi nucleotit của đoạn gen L1 phân lập từ bệnh phẩm trên ngân hàng gen sử dụng công cụ BLAST/Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/): kết quả giải trình tự đƣợc minh họa ở Hình 3.15.
Kết quả giải trình tự cho thấy peak rõ nét, đảm bảo cho việc định type HPV bằng phần mềm BLAST.
Bảng 3.12. Kết quả đối chiếu sự tƣơng đồng trình tự nucleotide với kiểu gen HPV11 của các chủng HPV phân lập ở mô polyp mũi xoang
Tên loại Virus có kết quả tƣơng đồng Giá trị Số Độ tƣơng đồng lớn nhất Tổng độ tƣơng đồng Độ bao phủ Tƣơng đồng Human papillomavirus isolate H223 late protein L1 gene, partial cds
169 169 100% 99% KR674077.1
Human papillomavirus
isolate H079
nonfunctional late protein L1 gene, partial sequence
169 169 100% 99% KR674054.1 Human papillomavirus type 11 isolate F-213- HPV11 L1 capsid protein gene, partial cds 167 167 98% 99% KM501531.1 Human papillomavirus type 11 isolate Ir-RRP8 L1 protein (L1) gene, partial cds
167 167 98% 99% GU344782.1
Human papillomavirus type 11 isolate Ir-PC43 L1 protein (L1) gene, partial cds
167 167 98% 99% GU344763.1
Nh n xét:
Qua kết quả đối chiếu với ngân hàng gen trên đây cho thấy kiểu gen của mẫu bệnh phẩm số 7 c sự phù hợp với chủng HPV 11 trên thế giới.
So với HPV kiểu gen 11 chủng H223 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-99%.
So với HPV kiểu gen 11 chủng H079 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-99%.
tƣơng đồng từ 95-99%. So với HPV kiểu gen 11 chủng Ir-RRP8 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-99%. So với HPV kiểu gen 11 chủng Ir- PC43 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-99%.
Bảng 3.13. Tỉ lệ phân bố kiểu gen HPV ở mô bệnh nhân UNĐNMX, UTMX và polyp mũi xoang phân tích bằng so sánh Genbank bằng cơng cụ BLAST/Search
Nh n xét:
Bằng phƣơng pháp so sánh Genbank dùng công cụ BLAST/Search tất cả các chủng HPV đƣợc giải trình tự gen cho thấy kiểu gen HPV 11 phổ biến trong các mẫu kiểm tra, trong đ u nhú đảo ngƣợc mũi xoang c 18/20 mẫu (90%), ung thƣ mũi xoang c 25/27 mẫu (92,6%) và polyp c 3/3 mẫu (100%). Chỉ c 2 trƣờng hợp (10%) u nhú đảo ngƣợc mũi xoang thấy kiểu gen HPV 6 và bệnh nhân ung thƣ mũi xoang c kiểu gen HPV 16 (7,4%).
3.2.2.2. Kết quả phân tích kiểu gen HPV bằng phương pháp phân tích nguồn gốc phát sinh loài và dựng cây phân loài (Phylogenetic Analysis and Genetic Tree)
Bằng phƣơng pháp chuẩn trên thế giới về phân tích nguồn gốc phát sinh lồi là dựa trên trình tự gen tham chiếu các kiểu gen của HPV có sẵn trên ngân hàng gen (GenBank) so sánh với trình tự đoạn gen của các chủng HPV trong mẫu nghiên cứu của các nhóm, kết quả về kiểu gen hoặc dƣới kiểu gen (subgenotype) của chủng nghiên cứu thu đƣợc kết luận phải dựa trên khoảng
Nhóm Kết quả
UNĐN MX (1) UTMX (2) POLYP (3)
n % n % n %
HPV 6 2 10,0 0 0,0 0 0,0
HPV 11 18 90,0 25 92,6 3 100
HPV 16 0 0,0 2 7,4 0 0,0
cách di truyền của chúng so với chủng tham chiếu đã xác định đƣợc tính bằng cách sử dụng phƣơng pháp Kimura với hai tham số [61] và cây phát sinh loài đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbour-Joining [62]. Phân tích chúng tôi thu đƣợc kết quả của các nh m nhƣ sau:
- Nhóm u nhú đảo ngƣợc mũi xoang:
(B)
Hình 3.17. Kết quả phân tích kiểu gen HPV bằng phƣơng pháp phân tích nguồn gốc phát sinh lồi ở nh m UNĐN MX.
(A). Trình t nucleotide c a các ch ng HPV phân l p ở mô UNĐN MX c a bệnh nhân so với các ch ng HPV tham chiếu c a các ki u e ã ết trên ngân hàng gen hiệu chỉnh bằng ph n m m Bioedit; (B) Phân tích và d ng cây
phân loài bằ ơ á a Kimura và CS (2016). S ế ó
phân tích ằ ơ á Ne or-Joining [61] K oả á á r ây â o xá ị ớ ộ á = 2.80773265
[73] Cây â o eo ỷ ệ, ớ u á ro ơ ị ố oả á ế ó ử ụ ây á o K oả á ế ó o HPV oá ằ ơ
pháp Maximum Composite Likelihood [73] Cá m ếu â u e HPV á â ừ óm UNĐN MX ổ 34 rì u eo e P â ế ó ế ử ụ m m MEGA7 [63].
Phân tích trình tự nguồn gốc phát sinh loài của 20 chủng HPV ở mơ bệnh nhân UNĐN MX cho thấy có 13 chủng (65%) thuộc kiểu gen HPV 31 (UN-1, 4, -8, -12, -23, -27, -38, -40, -50, -52, -53, -55, -57): 5 chủng (25%) thuộc kiểu gen HPV11 (UN-63, -58, -64, -80 và -81) và 2 chủng (10%) thuộc kiểu gen HPV6 (UN-61 và -68): khơng có chủng nào thuộc kiểu gen HPV16.
Kiểu gen HPV-31 chiếm ƣu thế ở bệnh nhân UNĐN mũi xoang, tiếp đến kiểu gen HPV11 và HPV6.
Có sự khác biệt rõ giữa kết quả phân tích kiểu gen bằng phƣơng pháp so sánh trình tự ngân hàng gene bằng công cụ Blast/Search (90% kiểu gen HPV11 và 10% kiểu gen HPV6) ở mô bệnh nhân UNĐN MX (Bảng 3.13) so với phƣơng pháp phân tích nguồn gốc phát sinh lồi kết hợp dựng cây phân loài (Phylogenetic Analysis and Genetic Tree) cho kết quả đúng với HPV11 chỉ 25%, HPV31 là 65%.
- Nhóm ung thư mũi xoang:
(B)
Hình 3.18. Kết quả phân tích kiểu gen HPV bằng phƣơng pháp phân tích nguồn gốc phát sinh loài ở nh m Ung thƣ mũi xoang.
(A). Trình t nucleotide c a các ch ng HPV phân l p ở mô u a bệnh nhân UTMX so với các ch ng HPV tham chiếu c a các ki u e ã ết trên ngân hàng gen sử dụng ph n m m Bioedit; (B) Phân tích và d ng cây phân lồi bằng ơ á a Kimura và CS (2016).
Phân tích trình tự nguồn gốc phát sinh lồi của 27 chủng HPV phân lập ở mô bệnh nhân ung thƣ mũi xoang cho thấy có 20 chủng thuộc kiểu gen HPV 11 (KMX-3, -12, -16, -18, -20, -22, -23, -28, -31, -33, -34, -35, -41, -43, -45, -47, -53, -54, -57, -58): 5 chủng thuộc kiểu gen HPV31 (KMX-7, -8, -59, -61 và -62) và 2 chủng thuộc kiểu gen HPV16 (KMX-40 và -42): khơng có chủng nào thuộc kiểu gen HPV6.
Kiểu gen HPV11 chiếm ƣu thế ở bệnh nhân ung thƣ mũi xoang, tiếp đến kiểu gen HPV31 và HPV16.
- Nhóm Polyp mũi xoang:
Hình 3.19. Kết quả phân tích kiểu gen HPV bằng phƣơng pháp phân tích nguồn gốc phát sinh loài ở nh m Polyp mũi xoang.
(A). Trình t nucleotide c a các ch ng HPV phân l p ở mô Po y mũ xo c a bệnh nhân so với các ch ng HPV tham chiếu c a các ki u e ã ết trên ngân hàng gen sử dụ ơ rì B oe ; (B) P â ng cây phân loài bằ ơ á a Kimura và CS (2016).
Phân tích trình tự nguồn gốc phát sinh lồi của 3 chủng HPV phân lập ở mô bệnh nhân polyp mũi xoang cho thấy cả 3 chủng thuộc kiểu gen HPV 11 (POL-7, -12 và -17): khơng có chủng nào thuộc kiểu gen HPV-6, -16, -31.
Bảng 3.14. Tổng hợp tỉ lệ phân bố kiểu gen HPV ở các nhóm nghiên cứu đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp phân tích nguồn gốc phát sinh lo i
Nh n xét:
Bằng phƣơng pháp phân tích nguồn gốc phát sinh loài tất cả các chủng HPV, kết quả c sự khác biệt về kiểu gen HPV so với phƣơng pháp so sánh trình tự ngân hàng gene bằng cơng cụ Blast/Search: ở nh m UNĐN MX và UTMX với kiểu gen HPV31 với tỷ lệ theo thứ tự là 65% và 18,5% ở mỗi nh m, không c trƣờng hợp HPV31 nào ở nh m Polyp MX.
Nhóm Kiểu gen
UNĐN MX (1) UTMX (2) POLYP (3) Cộng n (%) n % n % n % HPV 6 2 10,0 0 0 0 0 2 (4) HPV 11 5 25,0 20 74,1 3 100 28 (56) HPV 16 0 0 2 7,4 0 0 2 (4) HPV 31 13 65,0 5 18,5 0 0 18 (36) Cộng 20 100 27 100 3 100 50 (100)
3.3. Phân tích mối liên quan của nhiễm HPV với m t số đặc điểm lâm sàng bệnh nhân UNĐN MX
Bảng 3.15. Phân bố bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc mũi xoang có nhiễm HPV theo tuổi
Nhóm Tuổi
U nhú ĐNMX Polyp Ung thƣ mũi xoang
n HPV(+)(%) n HPV(+)(%) n HPV(+)(%) ≤29 5 1 (20,0) 7 0 (0) 4 1 (25,0) 30-39 11 2 (18,2) 8 2 (25,0) 4 1 (25,0) 40-49 19 5 (26,3) 6 0 (0) 14 7 (50,0) 50-59 27 7 (25,9) 9 1 (11,1) 30 12 (40,0) 60-69 12 3 (25,0) 3 0 (0) 9 4 (44,4) ≥70 7 2 (28,6) 2 0 (0) 6 2 (33,3) Tổng số 81 20 (24,7) 35 3 (8,6) 67 27 (40,3) Nh n xét:
Bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc mũi xoang tập trung chủ yếu ở độ tuổi 40- 59, số ca bệnh c HPV cũng đƣợc phát hiện nhiều ở nh m tuổi này, tuy nhiên tỉ lệ mắc HPV xuất hiện với tần suất khá đều ở các nh m tuổi. Không c sự khác biệt c ý nghĩa thống kê về tỉ lệ mắc HPV ở các nh m tuổi giữa hai nh m bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc và ung thƣ mũi xoang.
Nhóm bệnh nhân polyp c tỉ lệ mắc HPV thấp, chúng tôi phát hiện thấy trong các nh m tuổi 30-39 và 50-59. Các nh m tuổi khác, chúng tôi không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào nhiễm HPV.
Nh m bệnh nhân ung thƣ mũi xoang, tỉ lệ phát hiện HPV rất cao ở hầu hết các nh m tuổi, với tỉ lệ phát hiện chung là 40,3%.
Bảng 3.16. Liên quan bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc mũi xoang có nhiễm HPV theo giới Giới Nhóm Nam (1) Nữ (2) p n HPV (+) (%) n HPV (+) (%) UNĐN MX (a) 51 15 (29,4) 30 5 (16,7%) p1-2 >0,05 Polyp (b) 20 1 (5,0) 15 2 (13,3) p1-2 >0,05 Ung thƣ MX (c) 34 13 (38,2) 33 14 (42,4) p1-2 >0,05 p - pa-b<0,05 (X2=4,9; OR=7,9; 95% CI: 1,03- 350); - pc-b<0,01 (X2=7,24; OR=11,7; 95% CI: 1,44- 525); - pa-b>0,05; - pc-b<0,05 (X2=3,93; OR=4,79; 95% CI: 0,84- 49); Nh n xét:
Nguy cơ mắc u nhú đảo ngƣợc mũi xoang ở nam giới c HPV-ADN cao hơn 7,9 lần so với mắc polyp với độ tin cậy 95%.
Nguy cơ mắc ung thƣ mũi xoang ở nam giới c HPV-ADN cao hơn 11,7 lần so với mắc polyp với độ tin cậy 95%.
Ngƣợc lại, trên đối tƣợng nữ, nguy cơ mắc u nhú đảo ngƣợc mũi xoang có HPV-ADN khơng khác biệt c ý nghĩa thống kê so với mắc polyp.
Nhƣng nguy cơ đối tƣợng nữ mắc ung thƣ mũi xoang có HPV-ADN cao hơn so với mắc polyp 4,79 lần với độ tin cậy 95%.
Bảng 3.17. Liên quan đặc điểm cơ năng bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc mũi xoang với nhiễm HPV
Nh n xét:
Các dấu hiệu cơ năng của bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc mũi xoang phổ biến là nghẹt mũi, chảy mũi, đau đầu và chảy máu mũi không c sự khác biệt c ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm HPV (+) và HPV (-).
Bảng 3.18. Liên quan giai đoạn của u nhú đảo ngƣợc mũi xoang với nhiễm HPV HPV Đặc điểm HPV(+) (n=20) HPV(-) (n=61) n % n % Nghẹt mũi 18 90,0 60 98,4 p p>0,05 Chảy mũi 6 30,0 28 45,9 p p>0,05
Chảy máu mũi 4 20,0 7 11,5
p p>0,05 Nhức đầu 8 40,0 23 37,7 p p>0,05 HPV Giai đoạn HPV(+) HPV(-) n % n % T1 (1) 1 12,5 7 87,5 T2 (2) 4 17,4 19 82,6 T3 (3) 9 30,0 21 70,0 T4 (4) 6 30,0 14 70,0 p p>0,05
Nh n xét:
Kết quả cho thấy, tỉ lệ HPV ADN (+) theo các giai đoạn của khối u nhú đảo ngƣợc mũi xoang không c sự khác biệt c ý nghĩa thống kê với nhóm khơng có HPV ADN .
Bảng 3.19. Liên quan bệnh nhân có nhiễm HPV theo vị trí u nhú đảo ngƣợc mũi xoang HPV Vị trí HPV(+) (n=20) HPV(-) (n=61) n % n % Phải (1) 8 24,2 25 75,8 Trái (2) 12 25,0 36 75,0 p p>0,05 Nh n xét:
Chúng tôi không nhận thấy có mối liên quan nào giữa sự phát hiện HPV-ADN với vị trí mắc u nhú đảo ngƣợc mũi xoang ở bên phải-trái trong