ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nghiên cứu tiến hành trên 183 bệnh nhân đƣợc chia thành 3 nhóm: - Nhóm 1. Gồm 81 bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc mũi xoang
- Nhóm 2. Gồm 35 bệnh nhân polyp mũi xoang - Nhóm 3. Gồm 67 bệnh nhân ung thƣ mũi xoang
Thời gian từ 2012 đến 2016, tại Bệnh viện Tai Mũi Họng thành phố Hồ Chí Minh và bệnh viện Ung bƣớu thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
2.2.1.Tiêu chuẩn chẩn đoán u nhú đảo ngược mũi xoang
Lâm sàng, khối u và xác định bằng giải phẫu bệnh lý mô u. Chọn mẫu
với các bệnh nhân đƣợc chẩn đoán UNĐN MX gặp tại Bệnh viện Tai Mũi Họng – Thành phố Hồ Chí Minh với các tiêu chuẩn sau:
Lâm sàng
Các triệu chứng cơ năng thƣờng gặp nhất nhƣ: nghẹt mũi, chảy nƣớc mũi, chảy máu mũi, mất ngửi, nhức đầu.
N i soi mũi xoang
Đại thể khối u có nhiều thùy, bề mặt có nhú, màu xám, bở, dễ chảy máu. Các hình dạng thƣờng gặp: chùm nho, quả dâu hoặc giống polyp.
CT Scan
Tất cả các bệnh nhân đều đƣợc chụp CT scan để đánh giá vị trí và mức độ xâm lấn của u ở mũi xoang với tổ chức xung quanh để làm tiêu chuẩn chọn hay loại ra khỏi mẫu nghiên cứu (xem phần loại trừ).
Giải phẫu bệnh
Tất cả các bệnh nhân có kết quả giải phẫu bệnh là u nhú đảo ngƣợc mũi xoang (trƣớc phẫu thuật qua nội soi mũi xoang bấm sinh thiết và kiểm chứng lại sau phẫu thuật..)
2.2.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán polyp mũi xoang
Lâm sàng
Là khối u đƣợc xác định một khối u lành tính, có thể đơn thuần ở hốc mũi, trong xoang, hay cả trong xoang và hốc mũi. Khối polyp trong, trơn, nhẵn bóng và có màu phớt hồng, đơi khi c 1 vài tia mạch máu nhỏ.Thăm dị thấy mềm, di động, có cuống, đơn độc hay thành chùm, che bít hốc mũi. Mủ đọng ở sàn hay khe mũi khi bội nhiễm.
Giải phẫu bệnh lý
Polyp mũi xoang: (đƣợc phủ hoàn tồn bởi lớp biểu mơ phủ trụ, vng hay dẹt, bên trong là tổ chức liên kết dạng nhầy thƣa với các tế bào xơ tạo thành lớp lỏng lẻo, chứa dịch nhầy, có sự thâm nhập của bạch cầu ái toan, tế bào lympho, tƣơng bào).
2.2.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán ung thư mũi xoang
Lâm sàng
Khối u sùi, loét, bở, dễ chảy máu khi chạm vào. Khối u ban đầu ở hốc mũi hay các xoang cạnh mũi, sau đó xâm lấn sang tổ chức xung quanh nhƣ sàn sọ, ổ mắt.
Giải phẫu bệnh lý:
Ung thƣ biểu mô mũi xoang
2.2.4. Tiêu chuẩn loại trừ
Loại trừ tất cả các bệnh nhân khi có kết quả giải phẫu bệnh khối u khơng phải nằm trong 3 nhóm nghiên cứu trên (khơng phải polyp, không phải ung thƣ, không phải UNĐN MX).
2.2.5. Trang bị, hóa chất nghiên cứu
2.2.5.1. Trang thiết bị nghiên cứu
- Bộ dụng cụ khám tai mũi họng thơng thƣờng, kìm bấm sinh thiết. - Bộ nội soi ph ng đại ống cứng 0o, 30o, 70o và các thiết bị kèm theo (nguồn sáng, dây dẫn, màn hình, camera, chụp ảnh).
- Máy Real-time PCR (IQ5) của hãng BioRad - Máy PCR Light cycler 96 của Roche Diagnostics. - Máy giải trình tự gen tự động ABI 3130XL.
- Máy soi gel tia UV-VIS của BioRad.
- Máy Nano Drop ND-1000 (Thermo-Scientific, USA). - Máy khuấy từ gia nhiệt IKA (Đức).
- Máy ly tâm.
- Máy lắc ổn nhiệt 37oC. - Lị vi sóng (Sharp).
- Bộ điện di ADN và nguồn điện điện di Scieplar (Bio - Rad). - Máy soi thạch và chụp ảnh tự động (Gel - Doc).
- Pipet các loại và các dụng cụ thủy tinh khác.
Hình 2.1. Máy NanoDrop 1000, Thermo Scientific, Hoa Kỳ. - Dao cắt mẫu - Dao cắt mẫu
- Micropipet
- Bộ đĩa thủy tinh để cắt mẫu
Dụng cụ phải đƣợc vô trùng tuyệt đối (hấp sấy vơ trùng).
Hình 2.2. Máy Realtime-PCR IQ5 của Hãng Bio-RAD (Hoa Kỳ)
2.2.5.1. V t liệu và hóa ch t nghiên cứu
- Agarose, enzyme Proteinase K (hãng Sigma, Hoa Kỳ). - Cột lọc
- Giấy parafin
- Bộ kít tách ADN tổng số từ mô sinh thiết (Qiamp ADN Mini Kit, Hãng QIAGEN Cộng hịa Liên bang Đức).
- Kít tách ADN tổng số từ mô vùi parafin (MagMax FFPE DNA Ultra kit, HãngThermo Scientific (Hoa Kỳ).
- Các hóa chất dùng trong phản ứng nested-PCR và real time nested- PCR SYBR, real time PCR Taqman probe để nhân bản đoạn gen đặc hiệu cho HPV và gen b-actin bao gồm: PCR nTaq Hot, TOPreal™ qPCR 2X PreMIX (SYBR Green), TOPreal™ qPCR 2XPreMIX (TaqMan Probe), đều mua của hãng Enzynomics, Hàn Quốc.
- Đối chứng dƣơng của phản ứng PCR/ real time nested PCR là hỗn hợp các mẫu ADN tinh sạch từ mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với HPV genotype 6 và 11 và đối chứng âm là ADN tinh sạch từ mẫu bệnh phẩm âm tính với HPV do bệnh viện Da liễu trung ƣơng cung cấp đƣợc xác định đồng thời bằng bộ kit GF test (Diagcor, Hồng Kong) và HPV 6/11 Real-TM kit (Saccase- Ý).
- Cặp mồi: GP5+/ GP6+ và GP7/ GP8 đƣợc sử dụng theo trình tự đã đƣợc công bố trƣớc đây, và đƣợc đặt tổng hợp bởi IDT (Hoa Kỳ) [56].
Bảng 2.1. Các cặp mồi dung trong phản ứng nested- PCR Vùng Vùng
gene Tên mồi Trình tự mồi (5’- 3’)
Kích thƣớc (bp) LP1 GP7 (F) GP8 (R) TTTAATAARCCATATTGGYTRCA‟ ATTCATAGTATGWATATAKGYCAT‟ 270 LP1 GP5+ (F) GP6+ (R) TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC‟ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 140-150 Các hóa chất này đƣợc bảo quản và sử dụng theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
Theo phƣơng pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang c đối chứng, kết hợp thực nghiệm labo, phân tích và so sánh.
Các đối tƣợng đƣợc lựa chọn vào nghiên cứu đều đƣợc khai thác tiền sử, bệnh sử, khám xét cẩn thận, tỷ mỉ và làm đầy đủ các xét nghiệm theo mẫu bệnh án nghiên cứu thống nhất.
2.3.2. Các thơng số nghiên cứu
Nhóm u nhú đảo ngƣợc mũi xoang
- Tuổi, giới.
- Tiền sử bệnh: dị ứng, tái phát, bệnh mũi xoang - Thói quen (uống rƣợu, hút thuốc lá).
- Các đặc điểm lâm sàng.
- Nội soi mũi xoang, CT scan, chẩn đoán giai đoạn bệnh. - Đặc điểm giải phẫu bệnh.
- Các đặc điểm nhiễm HPV: có/khơng nhiễm HPV (Real time SYBR PCR, nested PCR), kiểu gen HPV (giải trình tự gen, dựng cây phân lồi).
- Mối liên quan đặc điểm lâm sàng, nội soi… với HPV.
Nhóm polyp mũi xoang
Các đặc điểm nhiễm HPV: có/khơng nhiễm HPV (Real time SYBR PCR, nested PCR), kiểu gen HPV (giải trình tự gen, dựng cây phân lồi).
Nhóm ung thƣ mũi xoang
Các đặc điểm nhiễm HPV: có/khơng nhiễm HPV (Real time SYBR PCR, nested PCR), kiểu gen HPV (giải trình tự gen, dựng cây phân lồi)2.3.3. Các phƣơng pháp tiến hành
2.3.3.1. P ơ á ứu âm
- Mỗi bệnh nhân đƣợc đăng ký theo dõi vào phiếu theo dõi đã đƣợc xây dựng c đầy đủ các chỉ tiêu về dịch tễ, lâm sàng và xét nghiệm.
Đối với bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc mũi xoang : Tất cả các bệnh nhân đều đƣợc chụp CT scan để đánh giá vị trí và mức độ xâm lấn khối u mũi xoang với tổ chức xung quanh và để c hƣớng phẫu thuật thích hợp. Cũng nhƣ qua CT scan có thể phát hiện những cấu trúc giải phẫu dị dạng, bất thƣờng để tránh những biến chứng có thể xảy ra.
Chủ yếu dựa vào hình ảnh CT scan và biên bản phẫu thuật để chẩn đoán giai đoạn của u nhú đảo ngƣợc mũi xoang. Theo Krouse (2000): u nhú đảo ngƣợc mũi xoang chia làm bốn giai đoạn: [57]:
T1: Khối u nằm trong hốc mũi, chƣa phát triển vào xoang; khơng có tổn thƣơng ác tính.
T2: Khối u phát triển tới vùng phức hợp lỗ ngách và xoang sàng, hoặc thành trong xoang hàm; khơng có tổn thƣơng ác tính.
T3: Khối u chiếm tồn bộ xoang hàm; hoặc lan vào xoang bƣớm; hoặc lan vào xoang trán; khơng có tổn thƣơng ác tính.
T4: Khối u vƣợt khỏi phạm vi mũi xoang (xâm lấn ổ mắt, nội sọ, hố chân bƣớm hàm) hoặc có tổn thƣơng ác tính.
2.3.3.2. Xét nghiệm mô bệnh h c
* Chẩn đốn mơ bệnh học đƣợc tiến hành theo các bƣớc:
- Lấy bệnh phẩm sau phẫu thuật u nhú đảo ngƣợc, polyp và khối u mũi xoang.
- Cố định bệnh phẩm bằng Bouin. - Khử nƣớc bằng cồn ethylic 70o-100o. - Khử cồn bằng dung dịch xylen. - Tẩm paraffin để khử xylen.
- Đúc bloc nến paraffin.
- Cắt mảnh bệnh phẩm paraffin.
- Dán mảnh cắt bệnh phẩm trên phiến kính. - Nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE).
- Đọc tiêu bản.
2.3.3.4 P ơ á c phân tử xá ịnh HPV-ADN và ki u gen HPV
Kỹ thuật lấy mẫu
Mô nghiên cứu đƣợc sinh thiết 3 mảnh trên mô u của mỗi bệnh nhân nhóm 1 và nhóm 2, cho vào ống Eppendorf 2 ml có nắp xốy, cho ngay vào tủ bảo quản ở - 80 0C đến khi sử dụng.
Nhóm 3 mẫu mơ ung thƣ mũi xoang đƣợc tách từ mẫu mơ đƣợc chẩn đốn xác định ung thƣ mũi xoang vùi trong parafin
Kỹ thuật tách và tinh sạch ADN từ mẫu mô sinh thiết
Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số từ mô sinh thiết sử dụng bộ kit Qiamp DNA Mini Kit (QIAGEN) theo qui trình hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Mẫu sau khi nghiền trong nitơ lỏng, hòa tan trong 200 ul PBS. Tiếp tục tách ADN tổng số theo qui trình gồm các bƣớc sau:
Bƣớc 1. Cho 20 l Protease K vào tube eppendorf 1,5 ml. Sau đ cho vào 200 l dung dịch mẫu đã nghiền trong PBS.
Bƣớc 2. Cho 200 l buffer AL vào mẫu sau đ lắc trộn trong 15 giây. Bƣớc 3. Ủ ở nhiệt độ 56 0
C trong 10 phút, ly tâm ngắn.
Bƣớc 4. Cho 200 l cồn tuyệt đối vào mẫu sau đ lắc trộn 15 giây, rồi ly tâm 15 giây.
Bƣớc 5. Chuyển toàn bộ sang cột lọc và đựng trong ống đi kèm (tube Qiamp spin column). Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch lọc và giữ lại cột.
Bƣớc 6. Cho 500 l Buffer AW1 để rửa cột. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút sau đ bỏ dịch lọc và giữ lại cột.
Bƣớc 7. Cho 500 l Buffer AW2. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút sau đ bỏ dịch lọc, giữ lại cột. Tiếp tục ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút.
Bƣớc 8. Chuyển cột sang một tube eppendorf 1.5 ml vô trùng. Sau đ thêm 200 l Buffer AE hoặc nƣớc cất khử ion. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút rồi ly tâm 8000 rpm trong 1 phút.
Bƣớc 9. ADN sau khi tách đƣợc đo nồng độ và đánh giá độ tinh sạch bằng máy Nano Drop ND-1000 (Thermo-Scientific, USA). Số đọc A260/A280 là tỉ lệ độ hấp thụ của mẫu ở hai bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Tỉ lệ này để đánh giá độ tinh sạch của ADN thu đƣợc. Tỉ lệ này nếu nằm trong khoảng 1,8- 2,2 thì mẫu ADN thu hồi đƣợc coi là tinh sạch.
Bƣớc 10. Thu ADN trong tube và bảo quản ở - 200
C.
Kỹ thuật tách và tinh sạch ADN từ mô vùi parafin
- Hóa chất: Sử dụng bộ kít thƣơng mại MagMax FFPE DNA Ultra kit (Thermo Scientific, USA) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
- Chuẩn bị RNase Solution: trƣớc tiên, chuẩn bị RNase Solution, bảo quản trên đá cho đến khi sử dụng: với tỷ lệ RNase A: Nuclease-Free Water là 1: 99 (thể tích RNase Solution cần dùng cho 1 phản ứng là 100 μl)
- Chuẩn bị mẫu
Bƣớc 1. Cắt 1 hoặc 2 miếng mẫu kích thƣớc khoảng 10 μm, chuyển sang các giếng thí nghiệm.
Bƣớc 2. 150 μl Digestion Buffer đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu và ngâm các mẫu ở trong đệm.
Bƣớc 3. 4 μl Proteinase K và 30 μl ADN Digestion Additive đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu.
Bƣớc 4. đĩa đƣợc che và ủ mẫu 60oC trong 60 phút, sau đ lên 80o
C trong 30 phút
Bƣớc 5. Trong thời gian ủ mẫu, chuẩn bị 620 μl Binding Solution cho mỗi phản ứng bao gồm 200 μl Binding Buffer và 420 μl isopropanol
Bƣớc 6. Sau khi ủ mẫu tại 80oC, thêm 620 μl Binding Solution vào mỗi giếng mẫu, spin đĩa mẫu trong 5 giây, ủ đĩa tại nhiệt độ phòng trong 5 phút
- Gắn ADN với Nucleic Acid Binding Beads
Bƣớc 1. 20 μl Nucleic Acid Binding Beads đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu, sau đ lắc trong 3 phút với tốc độ 3-4, mix các giếng mẫu cẩn thận bằng pipet 10-12 lần.
Bƣớc 2. Đĩa mẫu đƣợc đặt lên đế từ 96 trong 3-5 phút hoặc cho đến khi dung dịch sạch.
Bƣớc 3. Phần dịch nổi đƣợc hút bỏ nhẹ nhàng.
- Rửa Nucleic Acid Binding Beads
Bƣớc 1. Đĩa mẫu đƣợc nhấc ra khỏi đế từ 96, 150 μl Wash Solution 1 đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu.
Bƣớc 2. Đĩa mẫu đƣợc che và lắc với tốc độ 8 trong 1 phút.
Bƣớc 3. Đĩa mẫu đƣợc đặt lên đế từ 96 trong 1-2 phút hoặc đến khi dung dịch sạch.
Bƣớc 4. Phần dịch nổi đƣợc hút bỏ nhẹ nhàng.
Bƣớc 5. Đĩa mẫu đƣợc nhấc ra khỏi đế từ 96, 150 μl Wash Solution 2 đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu.
Lặp lại Bƣớc 2, 3, 4
Bƣớc 6. Không che đĩa mẫu và lắc trong 2 phút tại tốc độ 9 để làm khô Nucleic Acid Binding Beads.
- Xử lý Rnase A
Bƣớc 1. 100 μl Rnase Solution đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu, sau đ lắc trong 2 phút với tốc độ 8.
Bƣớc 2. Đĩa mẫu đƣợc che và ủ tại nhiệt độ 37o
C trong 20 phút. Bƣớc 3. Đĩa mẫu đƣợc lắc trong 5-10 phút với tốc độ 8.
Bƣớc 4. Rebinding Solution đƣợc chuẩn bị bao gồm 100 μl Rebinding Buffer và 200 μl Isopropanol cho mỗi phản ứng.
Bƣớc 5. 300 μL Rebinding Solution đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu sau đ lắc 3 phút.
Bƣớc 6. Đĩa mẫu đƣợc đặt lên đế từ 96 trong 3-4 phút hoặc để đến khi dung dịch sạch
Bƣớc 7. Dịch nổi đƣợc hút loại bỏ.
- Rửa và chiết đẩy mẫu
Bƣớc 1. Đĩa mẫu đƣợc nhấc ra khỏi đế từ 96, 150 μl Wash Solution 2 đƣợc cho vào mỗi giếng mẫu, đĩa mẫu đƣợc che và lắc trong 1 phút.
Bƣớc 2. Đĩa mẫu đƣợc đặt lên đế từ 96 trong 1-2 phút hoặc đến khi dung dịch sạch
Bƣớc 3. Dịch nổi đƣợc hút bỏ nhẹ nhàng.
Bƣớc 4. Đĩa mẫu không che và lắc để làm khô mẫu.
Bƣớc 5. 70 μl Elution Buffer đƣợc thêm vào, đĩa đƣợc che lại và lắc trong 1 phút.
Bƣớc 6. Đĩa mẫu đƣợc ủ và lắc trong 4 phút tại 80o
C.
Bƣớc 7. Đĩa mẫu đƣợc đặt lên đế từ 96 trong 3-4 phút hoặc đến khi dung dịch sạch.
ADN sau khi tách, đƣợc đo nồng độ và đánh giá độ tinh sạch bằng máy Nano Drop ND-1000 (Đã mô tả ở mục 2.3.4.3). Số đọc A260/A280 là tỉ lệ độ hấp thụ nằm trong khoảng 1,8- 2,2 thì mẫu ADN thu hồi đƣợc coi là tinh sạch.
Phản ứng PCR vòng 1 khuếch đại vùng gen L1 HPV sử dụng cặp mồi GP7/ GP8
Áp dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu theo nhóm (Group- specific PCR) phát hiện nhiều genotype HPV cùng một nhóm sử dụng cặp mồi suy biến GP7/ GP8 [56], DNA tinh sạch từ mẫu mô đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR vịng 1 khuếch đại đoạn gen đích c kích thƣớc 270 bp nằm trên gen L1 của HPV. Thành phần phản ứng PCR vòng 1 gồm: 10X nTaq Hot Buffer, dNTPs (2 mM), primer GP7/ GP8 (10 pmol), nTaq Hot (1 Unit), ADN, nƣớc cất khử trùng/ khử ion cho 20 µl tổng thể tích phản ứng. Phản ứng đƣợc thực hiện với chu trình luân nhiệt nhƣ sau:
- 01 chu kỳ biến tính ADN và hoạt hố Hot-Taq ở nhiệt độ 95o C trong 10 phút
- 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1. 94o C trong 30 giây. Bƣớc 2. 58o C trong 40 giây Bƣớc 3. 72o C trong 45 giây . - Cuối cùng duy trì trong 7 phút.
Real-time nested PCR SYBR vòng 2 phát hiện HPV sử dụng cặp mồi GP5+/ GP6+
Để hạn chế việc thao tác điện di kiểm tra kết quả khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của HPV, là nguyên nhân dẫn đến phản ứng nhiễm chéo (carrier- over) của sản phẩm PCR vào mastermix gây hiện tƣợng dƣơng tính giả, kỹ thuật real time nested-PCR SYBR 2 sử dụng mồi đặc hiệu GP5+/ GP6+
khuếch đại đoạn gen đặc hiệu trên gen LP1 của HPV đƣợc áp dụng [56]. 5 µl