4.3.2 .HPV liên quan với sự tái phát củ au nhú đảo ngƣợc mũi xoang
1.4. Cấu trúc HPV
*N u : theo Schiffman M. và cs (2016). [18].
- Vùng điều khiển dài (Long Control Region - LCR): có các gen khơng mã hố cho protein, hơn nữa n điều hoà cho việc sao chép và nhân lên của virus. Vùng điều hồ trên có những vị trí liên kết cho những yếu tố sao chép tế bào nhƣ hoạt hoá protein 1 và yếu tố 1 sao chép đặc hiệu tế bào keratin (keratinocyte) (KRF1). Ngƣời ta biết rằng týp HPV-16 hoặc -18 có những dạng khác nhau của KRF1. Liên kết yếu tố này với LCR điều hoà hoạt động
khung đọc mở trong vùng sớm của genom. Vùng sớm có những khung đọc mở và những mã của các protein dùng để sao chép virus và chuyển dạng tế bào. Vùng sớm c các khung đọc mở (E1-E8): gen E3 và E8 chỉ thấy ở một số chủng HPV, chức năng không rõ ràng [14].
Protein đƣợc mã hoá bởi gen E1 và gen E2 của HPV cũng tham gia việc nhân lên của ADN. Những protein đƣợc mã ở E1 liên kết với LCR gần gen E6. Gen E1 là một trong hai vùng gen bảo tồn nhất của HPV (cùng với gen L1) mã hóa cho protein chức năng c vai trò cần thiết cho quá trình sao chép ADN và plasmid. Protein gen E1 c kích thƣớc khoảng 73 kDa, nó liên kết với một chuỗi ADN cụ thể (vị trí liên kết E1, E1BS) trong nguồn gốc sao chép của virus và cùng với protien thứ 2 (E2) tập hợp thành các phức hợp hexameric. Phức hợp thu đƣợc có hoạt tính helicase (thực hiện q trình tháo xoắn) và giúp chuỗi gen của virus duỗi ra trong quá trình sao chép. Hoạt động tháo xoắn ADN của E1 không cần ATP [17], [18]. E1 cũng tƣơng tác với protien nhân bản A (RPA): dẫn đến sự ổn định nhanh chóng của ADN sợi đơn đƣợc tạo ra bởi hoạt động helicase E1 [20]. Các protein này có cả enzym ATPase và hoạt tính heilcase.
Gen E2 của HPV mã hóa cho 2 protein c độ dài khác nhau, giúp điều hồ kết nối chúng với LCR. Vai trị chủ yếu của protein E2 là làm tăng gắn kết của protein E1 với LCR. Ngoài chức năng trong sao chép ADN của virus. Gen E2 cịn mã hóa một sản phẩm protein khoảng 40 - 45 kDa. Protein này đ ng vai trò chủ đạo trong quá trình phiên mã cũng nhƣ trong quá trình điều hịa giải mã và quy trì ADN virus ở ngồi NST. Chức năng điều hòa giải mã của E2 đƣợc thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong LCR và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của E2 trong quá trình phiên mã. Sự biểu hiện của protein HPV E2 ở các mức khác nhau trong tế bào ngƣời dẫn đến sự ức chế phiên mã từ promoter virus. Sự gián đoạn hoặc im lặng của gen E2 dẫn
đến tăng khả năng biểu hiện của gen gây ung thƣ E6 và E7. Ngoài ra, E2 còn đ ng vai trò trong việc phân tách ADN virus mới đƣợc sao chép với các NST sau phân bào, đảm bảo sự phân bố tƣơng tự của bộ gen virus trong các tế bào con. Ở giai đoạn cuối vòng đời của virus, chức năng phiên mã của gen E2 đƣợc giảm đi và hƣớng tới việc khuếch đại ADN của virus để tạo thuận lợi cho việc sản sinh ra thế hệ virus mới [17], [21], [22].
Mặc dầu gen E4 là 1 phần của vùng sớm, Gen E4 của HPV nằm trong vùng gen sớm và chồng chéo với E2 nhƣng đƣợc phiên mã trong một khung đọc khác nhau. Protein E4 là một sản phẩm hợp nhất với một chuỗi 5-amino acid từ đầu cuối N của E1 (q trình splicing giữa E1 và E4). Protein này có chức năng giúp cho quá trình trƣởng thành và giải phóng virus ra khỏi tế bào mà khơng làm tan tế bào chủ. Protein E1 và E4 chứa 3 dạng chính tác động vào chu kỳ sống của virus gồm:
- Dạng gen chứa nhiều leucin ở đầu tận cùng N liên quan đến keratin và cần thiết cho sự nhân lên của ADN. Vùng chứa nhiều prolin ở đoạn trung tâm, chứa vị trí threonin cần thiết cho khoảng nghỉ của chu kỳ tế bào tại giai đoạn G2/M và giải mã của phức hợp cyclinB/cdk1 ở bào tƣơng.
- Đầu tận C (C - teminal) chứa domain đơn, điều hòa khả năng gen E1 và E4 tạo ra sự polimerize, gắn với dead-box RNA helicase và tạo ra sự phá vỡ hệ thống sợi keratin [23]. Những protein này đƣợc mã tƣơng đối muộn trong vòng đời của virus.
Những protein này rất quan trọng để biệt hoá HPV. Protein E4 tƣơng tác với khung xƣơng cytokeratin của tế bào. Điều này cho phép các virus rời các tế bào đã nhiễm để tới gây bệnh cho các tế bào khác. Đây là nguyên nhân tạo thành các tế bào b ng kinh điển.
Các protein của virus cũng can thiệp vào thời kỳ phân bào và cytokinase. Điều này giải thích kết quả phổ biến là: có những tế bào đa nhân
trong tổn thƣơng tiền ung thƣ. Ngƣời ta thấy rằng những u condyloma liên quan đến virus nh m nguy cơ cao gây nhiều khả năng phân bào bất thƣờng hơn những condyloma liên quan đến nh m nguy cơ thấp. Gen E2 mã hoá cho vài peptid ở màng tế bào có keratin. Ít nhất, một chức năng của protein này là làm tăng tƣơng tác giữa yếu tố phát triển biểu mô với thụ thể và ligands của chúng. Bằng cách tăng cƣờng những tƣơng tác của chúng có thể làm tăng phát triển tế bào.
Trong một số cơng trình thực nghiệm cho thấy: Gen E5 mã hóa cho sản phẩm là protein E5. Protein này dài 83 acid amin. Việc phát hiện protein này rất khó do tính kỵ nƣớc, kích thƣớc nhỏ nằm ở phần màng golgi và lƣới nội chất của tế bào. Protein này cần thiết cho quá trình xâm nhập và tồn tại của virus trong tế bào chủ. Protein E5 là yếu tố tác động ngay trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm trong tế bào, tạo ra phức hợp với các thụ thể của yếu tố kích thích tăng trƣởng và biệt hóa tế bào đồng thời giúp cho virus lẩn trốn đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ.
Mặt khác, protein E5 cịn có vai trị trong việc ngăn chặn sự chết theo chu trình (apotosis) của tế bào. E5 có thể ức chế đáp ứng của vật chủ với sự phát triển của những tân sản. Khả năng của E5 gây nên sự biến đổi của tế bào do gen E5 có khả năng hoạt hóa receptor của yếu tố phát triển và ức chế ATPase không bào [24].
Gen E6 và E7 mã cho các prtein là sản phẩm chuyển dạng chính của HPV [14].
-E6: Protein HPV E6 là các polypeptide nhỏ cỡ 150 axit amin và chứa hai nguyên tố kẽm (Zn). Sự nguyên vẹn của chúng là điều cần thiết cho chức năng chính của E6. E6 mã hóa cho một protein cơ bản với hai nguyên tố Zn ở đầu tận C (C - teminal). Các protein E6 của HPV nguy cơ cao thuộc loại oncoprotein và có thể làm biến đổi các tế bào tuyến vú của ngƣời và liên kết
với E7 trong việc biến đổi các tế bào sừng bao quy đầu của con ngƣời. E6 đƣợc biểu hiện sớm sau khi nhiễm virus và tạo điều kiện cho virus nhân lên bằng cách tạo ra một số thay đổi của tế bào nhƣ: kéo dài tuổi thọ của tế bào thơng qua ức chế q trình chết của tế bào theo chƣơng trình (apoptosis); tăng cƣờng hoạt hóa telomerase. Qua đ , HPV E6 tƣơng tác với một phân giải ubiquitin, các protein liên kết E6 (E6-AP ) và các dạng kết hợp với p53 bị phân giải thông qua các cơ chế ubiquitin phụ thuộc. Hơn nữa, E6 có thể ngăn chặn sự di chuyển của p53 vào nhân và do đ ức chế chức năng điều tiết của gen p53. Hậu quả, của việc phân hủy p53 và ngăn chặn vận chuyển p53 vào nhân làm cho p53 không thể làm trung gian kiểm soát chu kỳ phân bào, do vậy tế bào tiếp tục phân chia mặc dù ADN bị phá hủy [14]. Bình thƣờng, khi có tín hiệu phá hủy tế bào hoặc có sự sai hỏng trong q trình nhân lên của ADN, gen ức chế ung thƣ p53 đƣợc hoạt hóa, dẫn đến dừng chu kỳ tế bào và gây chết tế bào theo chƣơng trình (apotosis) thơng qua hoạt động giải mã của gen.
Ngồi ra, gen E6 cịn có khả năng gắn kết với protein PDZ dẫn đến sự thoái triển của protein PDZ, một protein đƣợc bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cần thiết cho sự phát triển, kết dính, tăng sinh, biệt hóa và duy trì chu kỳ sống của tế bào. Liên kết với gen Ras trong quá trình bất tử tế bào và kích thích sự phát triển của dịng tế bào NIH3T3, đồng thời hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus [17], [18], [25].
E7 mã hóa cho một phosphoprotein có hai phức kẽm tại đầu C của protein, chúng rất cần thiết cho việc tạo ra một cấu trúc protein phù hợp và ổn định. Protein E7 chủ yếu đƣợc tìm thấy trong nhân tế bào và đã đƣợc chứng minh là gây ra sự tăng sinh tế bào, tế bào bất tử và chuyển dạng. Protein E7 gồm khoảng gần 100 acid amin, tuy kích thƣớc nhỏ hơn protein E6 nhƣng lại
giữ vai trị khơng kém phần quan trọng trong cơ chế gây ung thƣ ở tế bào chủ [26].
E7 tƣơng tác với các protein thuộc nhóm Rb (sản phẩm của gen ức chế ung thƣ). Liên kết của E7 pRB đƣợc tạo bởi yếu tố phiên mã E2F, dẫn đến kích hoạt phiên mã gen. Ngoài ra, E7 gây nguy cơ cao gián tiếp phân hủy pRB. Thông thƣờng, pRb bị thủy phân sớm ở chu kỳ của tế bào. Ở giai đoạn phosphorin hóa, pRb gắn với yếu tố sao chép E2F/DP (phức hợp hoạt hóa sao chép điều khiển sự bộc lộ các gen ở giai đoạn S) gây ức chế quá trình hoạt hóa phức hợp sao chép. Sang giai đoạn G muộn, pRb đƣợc phosphorine hóa bởi phức hợp cyclin/CDK, giải phóng phức hợp E2E/DP do đ các gen thúc đẩy giai đoạn S đƣợc hoạt hóa và giải mã.
Trong trƣờng hợp bị nhiễm HPV, sự bộc lộ gen E7 khơng cần q trình phosphorine hóa pRB để hoạt hóa phức hợp sao chép E2F. Sự kết hợp của E7 với pRB đã đƣợc khử phosphorine dẫn đến giải phóng phức hợp E2F/DP từ pRB và hoạt hóa tiếp theo của phức hợp E2F. Do đ , sự bất hoạt E7 của pRB tạo điều kiện cho HPV có khả năng vƣợt qua sự ức chế pRB trong chu kỳ tế bào [17], [18]. Khả năng của E7 liên kết pRB có ở cả nh m HPV gây nguy cơ ung thƣ cao và thấp, mặc dù sự tƣơng tác giữa E7 và pRB trong nhóm HPV nguy cơ gây ung thƣ thấp là yếu hơn nhiều. Hơn nữa, E7 trong nh m nguy cơ ung thƣ cao tƣơng tác với cyclin A và cyclin E đã làm gia tăng mức độ biểu hiện của các protein này. Thêm nữa, E7 kết hợp với chất ức chế của CDK (Cyclin Dependent Kinase): p21 và p27 làm ngăn cản sự hoạt động của chúng. Những protein E7 cũng tƣơng tác với các enzym histon de- acetylases (HDACs): điều này bổ sung với E2F để cảm ứng xúc tác bởi pRB và kiềm chế chức năng của E2F [18].
Chính vì vậy, khi 2 gen E6 và E7 của HPV tổng hợp protein thì các protein này tự tiếp xúc với pRB và p53 và sẽ gây cản trở quá trình điều chỉnh
sự phân chia tế bào. Kết quả là tế bào bị nhiễm HPV sinh sản tự phát, khơng có sự kiểm sốt, cấu trúc gen thay đổi , gen bị hƣ hại không thể sửa chữa đƣợc và phát triển thành tế bào ung thƣ. Do đ khi định typ HPV cần dựa vào sự khác nhau về trình tự các nucleotit trên gen E6/E7 (oncogens): chúng có mức độ biến đổi khác nhau và quyết định tính gây bệnh của virus.
Cũng cần đề cập tới vai trị của hai protein vơ cùng quan trọng tới chu trình tế bào, đặc biệt là kiểm sốt q trình sửa chữa ADN và chết tế bào theo chƣơng trình là pRb và p53. Các protein ức chế khối u p53 và pRb là hai con đƣờng truyền tín hiệu thƣờng xuyên bị thay đổi trong quá trình phát triển ung thƣ. Đột biến làm gián đoạn con đƣờng p53 và pRb có thể xảy ra trong trình tự gen hoặc trong bộ điều chỉnh ngƣợc dòng của chúng và / hoặc tác dụng xi dịng tín hiệu tế bào. Các kết quả nghiên cứu đã phát hiện ra rằng cả hai gen ức chế khối u đều bị bất hoạt ở nhiều loại ác tính nhƣ u xƣơng, phổi tế bào nhỏ, ung thƣ vú và ung thƣ bàng quang [19], [20], [21], [27]. Hơn nữa, sự thay đổi trong biểu hiện hoặc hoạt động của các protein liên quan đến con đƣờng truyền tín hiệu p53 và pRb đã đƣợc xác định trong u nguyên bào võng mạc và ung thƣ tuyến tụy, đại tràng và đầu và cổ [22], [23], [24], [25]. Số lƣợng lớn các bệnh ung thƣ c khiếm khuyết trong con đƣờng p53 và pRb chứng tỏ tầm quan trọng của các gen này trong việc ngăn ngừa sự phát triển và tiến triển của ung thƣ. pRB điều chỉnh quá trình chuyển đổi giữa pha G1 / G0- và S trong chu trình tế bào, có vai trị chính là thực hiện kiểm sốt chu kỳ tế bào để đáp ứng với tổn thƣơng ADN. Bằng chứng thực nghiệm đã liên kết sự bất hoạt đồng thời của p53- và con đƣờng Rb đối với sự phát triển ung thƣ hạch và sự đề kháng đối với cyclophosphamide ở chuột thông qua việc ngăn chặn sự lão hóa của tế bào, cũng nhƣ sự bất hoạt của tế bào keratinocytes. Con đƣờng này cũng c liên quan đến việc kháng thuốc gây tổn thƣơng ADN
ở bệnh nhân ung thƣ vú, tuy nhiên cơ chế đằng sau tác dụng này vẫn chƣa đƣợc làm rõ [19], [20], [27].
Vùng chậm của bộ gen HPV chứa 2 khung đọc mở mã hoá cho protein của capsid. Gen L1 mã hoá cho protein của capsid lớn hơn, n đƣợc bảo vệ cao trong tự nhiên. Gen L1 là gen cấu trúc, bảo tồn nhất của virus, mã hóa muộn cho protein chính của vỏ capsid. Protein này khoảng 55kD, có khả năng tự lắp ráp thành các hạt giống virus. Protein L1 tạo thành toàn bộ bề mặt bên ngồi của hạt virus trƣởng thành, nó là cầu nối gắn kết ban đầu với các mô hoặc tế bào chủ. Tƣơng tác ban đầu của capsid HPV với vật chủ chủ yếu là do tƣơng tác L1 với heparan sulfate (HS) carbonhydrate hiển thị trên proteoglycan. Điều này đƣợc hỗ trợ bằng cách ức chế sự gắn kết virion và lây nhiễm bằng cách hòa tan heparin (một dạng sulfate của HS) hoặc bằng cách loại bỏ HS bằng heparinase.
Gen L2 cũng là một vùng gen cấu trúc, mã hóa muộn cho protein vỏ capsid phụ của HPV, c kích thƣớc nhỏ hơn nhiều. Protein L2 chỉ đƣợc xuất hiện rất ít trong hạt virus và không cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid. Tuy nhiên, nó có vai trị quan trọng trong chu kỳ sống và trong quá trình xâm nhập của virus do có khả năng tạo sự gắn kết giữa receptor bề mặt tế bào với actin và với protein ức chế khối u PML (promyelocytic leukemia protein): cần thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm [18], [28]. Khung đọc mở vùng chậm đƣợc điều hoà bởi những yếu tố sao chép tế bào, nó khơng biểu hiện rõ trong tế bào biểu mơ khơng biệt hố. Vì vậy những gen vùng chậm chỉ đƣợc hoạt hoá trong những tế bào vảy ở bề mặt và trung gian [23], [29].
Bảng 1.1: Tổng hợp chức năng của các gen HPV
E1 Protein gen E1 c kích thƣớc 73KDa, liên kết tạo phức hợp hexameric có hoạt tính helicase, cần thiết cho sự sao chép ADN của virus. Hoạt động tháo xoắn của E1 không cần ATP
E2 Protein gen E2 khoảng 40 - 45 kDa, điều chỉnh chính của phiên mã gen virus; liên kết promoter phiên mã virus nhƣ một dimer; tham gia vào việc sao chép ADN của virus.
E4 Biểu hiện muộn trong chu kỳ sống của virus; tƣơng tác với keratin cytoskeleton và các sợi trung gian, đƣợc cho là tạo điều kiện thuận lợi cho việc lắp ráp và giải phóng virus.
E5 Protein E5 kích thƣớc 83 acid amin, gây ra sự gia tăng tế bào bất thƣờng, giúp virus lẩn trốn đáp ứng miễn dịch, ức chế quá trình apoptosis.
E6 Protein của gen E6 khoảng 150 acid amin, kích thích tế bào phân