4.3.2 .HPV liên quan với sự tái phát củ au nhú đảo ngƣợc mũi xoang
3.6. Hình ản hu nhú đảo ngƣợc mũi xoang đƣợc chẩn đoán trƣớc mổ
Bệnh nhân Huỳ V P 47 uổi (A: 40X, B:200X) sinh thiết c u trúc nhú (* hình A); TB dạng TB gai ( hình B) (BA.12.012679)
Bệnh nhân Huỳnh Văn P. đƣợc bấm sinh thiết trƣớc mổ qua nội soi, đƣợc chẩn đốn giải phẫu bệnh là hình ảnh điển hình của u nhú đảo ngƣợc mũi xoang, gồm tăng sản thƣợng bì malpighi, tạo các nhú và các mào lấn sâu vào mô đệm liên kết của thâm nhập viêm.
Hình 3.7. Hình ảnh carcinoma bọc-dạng tuyến đƣợc chẩn đốn sau mổ
Bệnh nhân Huỳ V P 47 uổi (Hình C: 40X, Hình D:200X): mẫu mơ có c u trúc nhú (* hình C); c u trúc dạng sàng (** hình C) tế bào b ờng
dạng tế bào áy ( hình D)
Tuy nhiên, hình ảnh giải phẫu bệnh của mô u sau phẫu thuật phát hiện thấy các tế bào nhỏ, nhân trịn, sẫm, bào tƣơng ít, xếp thành cấu trúc đa dạng hình dây, đám, khoang trịn nhỏ. Các khoang trịn đƣợc lót bởi một hoặc hai hàng tế bào thƣợng mơ. Mơ đệm có vùng thối hóa nhầy. Đây là hình ảnh của carcinoma bọc-dạng tuyến
carcinoma bọc-dạng tuyến.
Hình 3.8. Hình ảnh nghi carcinoma đƣợc chẩn đốn sau mổ
Bệnh nhân Nguyễn Minh H. 53 tuổi (Hình A: 40X, Hình B: 200X) (BA.13.012389)
Bệnh nhân Nguyễn Minh H. sau khi đƣợc phẫu thuật và mô bệnh học đƣợc thực hiện, cho thấy hình ảnh u nhú ngƣợc với hình ảnh nghi carcinoma thƣờng gặp của u nhú đảo ngƣợc mũi xoang, với một số vùng c các tế bào hình dài, dị dạng, xếp thành đám.
Hình 3.9. Hình ảnh carcinoma tế bào gai
Bệnh nhân Nguyễ V T 65 uổi (Hình A: 40X, Hình B: 200X) (BA.4958.16)
Bệnh nhân Nguyễn Văn T. đƣợc chẩn đốn mơ bệnh học, cho thấy hình ảnh UNĐN và hình ảnh ác tính của tế bào gai tăng sản, hợp thành đám, khơng tạo sừng. (* hình A); nhân TB dị dạng, nhiều nhân quái, nhân chia bất thƣờng (, hình B). Bệnh nhân đƣợc chẩn đoán carcinoma tế bào gai, biệt h a kém, phát triển trên nền u nhú đảo ngƣợc.
3.2. Tỷ lệ nhiễm HPV và kiểu gen của HPV ở mô u nhú đảo ngƣợc mũi xoang xoang
3.2.1. Tỷ lệ phát hiện HPV-ADN ở mô u nhú đảo ngược mũi xoang
Tổng số số lƣợng mẫu bệnh phẩm thu đƣợc: 81 mẫu u nhú đảo ngƣợc mũi xoang, 67 mẫu ung thƣ mũi xoang và 35 mẫu polyp mũi xoang, đều đƣợc tách ADN, kết quả ADN c độ tinh sạch trong khoảng kỳ vọng với giá trị OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,7-2,4, và kết quả real time PCR Taqman probe sử dụng ADN tinh sạch ở tất cả các mẫu đều cho giá trị Ct <35 của tín hiệu kênh HEX đại diện cho gen giữ nhà -globin (số liệu khơng trình bày ở đây).
Bảng 3.9. Tỉ lệ HPV-ADN ở mẫu mô bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc mũi xoang, ung thƣ mũi xoang, polyp mũi xoang
Nh n xét:
Trong số 81 bệnh nhân u nhú đảo ngƣợc mũi xoang, c 20 bệnh nhân (24,7%) phát hiện HPV-ADN trong mô sinh thiết.
Trong số 35 bệnh nhân polyp mũi xoang, c 3 trƣờng hợp (8,6%) phát hiện HPV-ADN. Nhóm HPV-ADN U nhú ĐN MX (1) Polyp mũi xoang (2) Ung thƣ mũi xoang (3) n % n % n % (+) 20 24,7 3 8,6 27 40,3 (-) 61 75,3 32 91,4 40 59,7 Tổng 81 100 35 100 67 100 p p1-2=0,046; X2=4,0 (OR=3,5; 95% CI: 0,92-19,6); p2-3=0,001, X2=11,2 (OR=7,2; 95% CI: 1,91-39,7)
A.
B.
Hình 3.10.Tín hiệu chạy Real-time nested PCR SYBR Green phát hiện HPV
(A) và tín hiệu Real-time PCR sử dụng Taqman probe kênh HEX (B) phát hiện gen gi nhà ß-globin trong mẫu mơ u ảo mũ xo . T ệu á mẫu ơ ằm r (2.5, ờ ẻ m u x ơ ) ơ ứ ớ ố u ỳ ở rụ o Mộ ố mẫu ó ệu yếu ( ằm á , xu ệ muộ ) ạy xá ạ ế uả (Hì ệu ô ệ ế á mẫu ệ â â )
Ngƣời c HPV-ADN c nguy cơ mắc u nhú đảo ngƣợc mũi xoang cao hơn 3,5 lần so với nguy cơ mắc polyp với độ tin cậy 95% (p =0,046; X2
=4,0; OR=3,5; 95% CI: 0,92-19,6).
A.
B.
Hình 3.11. Tín hiệu chạy Real-time nested PCR SYBR Green phát hiện HPV
(A) và tín hiệu Real-time PCR sử dụng Taqman probe kênh HEX (B) phát hiện gen gi nhà ß-globin trong một số mẫu mô u mũ xo T ệu á mẫu ơ ằm r (23.33, ờ ẻ m u x ơ ) ơ ứ ớ ố u ỳ ở rụ o Mộ ố mẫu ó ệu yếu ( ằm á , xu ệ muộ ) ạy xá ạ ế uả (Hì ệu ô ệ ế á mẫu ệ â â ).
Trong số 67 trƣờng hợp ung thƣ mũi xoang, chúng tôi phát hiện thấy 27 mẫu c HPV-ADN (40,3%): tỉ lệ này cao hơn c ý nghĩa thống kê so với nh m polyp và u nhú đảo ngƣợc mũi xoang.
A.
B.
Hình 3.12. Tín hiệu chạy Real-time nested PCR SYBR Green phát hiện HPV
(A) ệu Re - me PCR ử ụ T m ro e HEX (B) phát ệ e ß- o ro mộ ố mẫu mô o y mũ xo
T ệu á mẫu ơ ằm r (2.50, ờ ẻ màu xanh ơ ) ơ ứ ớ ố u ỳ ở rụ o Mộ ố mẫu ó ệu yếu ( ằm á , xu ệ muộ ) ạy xá ạ ế uả (Hì ệu ô ệ ế á mẫu ệ â â ).
Ngƣời c HPV-ADN có nguy cơ mắc ung thƣ mũi xoang cao hơn rõ rệt so với khả năng mắc polyp là 7,2 lần với độ tin cậy 95% (p=0,001, X2
=11,2; OR=7,2; 95% CI: 1,91-39,7).
3.2.2. Kiểu gen HPV-ADN ở mô u nhú đảo ngược mũi xoang
3.2.2.1. Kết quả phân tích giá trị tương đồng của trình tự HPV phân lập từ bệnh nhân so sánh trên ngân hàng gen (Genbank) bằng Blast search)
- Sự tương đồng trình tự nucleotide với của các chủng HPV phân lập ở mô UNĐN MX so sánh trên ngân hàng gen:
Sau khi đánh giá đƣợc tỷ lệ nhiễm HPV ở mô u nhú đảo ngƣợc của các bệnh nhân trong nghiên cứu, tất cả các sản phẩm nested-PCR của các mẫu HPV dƣơng tính và một vài sản phẩm HPV âm tính đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%. Sản phẩm PCR c băng rõ nét đƣợc tinh sạch và giải trình tự 2 chiều. Kết quả điện di của một số mẫu đại diện đƣợc thể hiện trong Hình 3.13.
Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm nested-PCR nhân bản HPV- ADN trong mô của một số bệnh nhân UNĐN MX, ung thƣ và polyp mũi xoang. mô của một số bệnh nhân UNĐN MX, ung thƣ và polyp mũi xoang.
Kết quả điện di sản phẩm nested PCR đều cho băng c kích thƣớc 150 bp duy nhất ở các mẫu dƣơng tính, các mẫu âm tính khơng thấy xuất hiện băng điện di. Kết quả này tƣơng thích với kết quả real time nested-PCR SYBR và đảm bảo chất lƣợng ADN khn cho việc giải trình tự gen đích.
Hình 3.14. Hình ảnh đại diện cho kết quả minh họa peak của một đoạn trình tự ADN vùng LP1 của HPV11 ở bệnh nhân Đỗ Văn T (BA.13.009205)
Kết quả trình tự tự động hiển thị trong hình thức của một sắc đồ. Các màu sắc đại diện cho bốn cơ sở: màu xanh là C, màu xanh lá cây là A, đen là G và màu đỏ là T.
Trong các mẫu u nhú đảo ngƣợc mũi xoang đƣợc phát hiện có mặt của HPV, kiểu gen HPV 11 đƣợc phát hiện bằng công cụ Blast Search. Kết quả giải trình tự cho thấy peak rõ nét, đảm bảo cho việc xác định kiểu gen HPV.
Bảng 3.10. Kết quả đối chiếu sự tƣơng đồng trình tự nucleotide với kiểu gen HPV11 của các chủng HPV ở mô u nhú đảo ngƣợc mũi xoang
Tên loại Virus có kết quả tƣơng đồng Giá trị Số Độ tƣơng đồng lớn nhất Tổng độ tƣơng đồng Độ bao phủ Tƣơng đồng Human papillomavirus
type 11 isolate 83A.11, complete genome 150 150 95% 97% KU298879.1 Human papillomavirus type 11 complete genome, isolate 30 150 150 95% 97% LN833190.1 Human papillomavirus type 11 complete genome, isolate 29 150 150 95% 97% LN833189.1 Human papillomavirus type 11 complete genome, isolate 28 150 150 95% 97% LN833188.1 Human papillomavirus type 11 complete genome, isolate 27 150 150 95% 97% LN833187.1 Nh n xét:
Sản phẩm cDNA của HPV đƣợc giải trình tự gen. Kết quả so sánh trình tự chuỗi nucleotit của đoạn gen L1 phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân Đỗ Văn T. trên ngân hàng gen sử dụng công cụ BLAST/Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/): kết quả giải trình tự đƣợc minh họa ở Hình 3.13. Qua kết quả đối chiếu với ngân hàng gen trên đây cho thấy kiểu gen của mẫu bệnh phẩm c sự phù hợp với chủng HPV 11 trên thế giới:
So với HPV kiểu gen 11 chủng 83A.11 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-97%. So với HPV kiểu gen 11 chủng 30 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-97%.
So với HPV kiểu gen 11 chủng 29 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-97%. So với HPV kiểu gen 11 chủng 28 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-97%. So với HPV kiểu gen 11 chủng 27 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-97%.
- Sự tương đồng trình tự nucleotide với của các chủng HPV phân lập ở mô UTMX so sánh trên ngân hàng gen:
Trên các mẫu bệnh phẩm UTMX phát hiện đƣợc HPV-ADN, có 2 kiểu gen HPV 11 và HPV 16 đƣợc phát hiện bằng công cụ Blast Search.
Bảng 3.11. Kết quả đối chiếu sự tƣơng đồng trình tự nucleotide với kiểu gen HPV16 của các chủng HPV phân lập ở mô ung thƣ mũi xoang
Tên loại Virus có kết quả tƣơng đồng Giá trị Số Độ tƣơng đồng lớn nhất Tổng độ tƣơng đồng Độ bao phủ Tƣơng đồng Human papillomavirus type 16 isolate 16CN47 major capsid protein L1 (L1) gene, complete cds
165 165 100% 97% KU951195.1
Human papillomavirus type 16 isolate 16CN46 major capsid protein L1 (L1) gene, complete cds
165 165 100% 97% KU951194.1
Human papillomavirus type 16 isolate 16CN45 major capsid protein L1 (L1) gene, complete cds
165 165 100% 97% KU951193.1
Human papillomavirus type 16 isolate 16CN44 major capsid protein L1 (L1) gene, complete cds
165 165 100% 97% KU951192.1
Human papillomavirus type 16 isolate 16CN42 major capsid protein L1 (L1) gene, complete cds
Nh n xét:
Kết quả so sánh trình tự chuỗi nucleotit của đoạn gen L1 phân lập từ bệnh phẩm số 20 trên ngân hàng gen sử dụng công cụ BLAST/Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Kết quả giải trình tự cho thấy peak rõ nét, đảm bảo cho việc xác định kiểu gen HPV bằng phần mềm BLAST.
Hình 3.15. Hình ảnh đại diện cho kết quả minh họa peak của một đoạn trình từ ADN vùng LP1 của HPV16 ở bệnh nhân ung thƣ mũi xoang Đặng Thị H.
(BA.14070.14)
Qua kết quả đối chiếu với ngân hàng gen trên đây cho thấy kiểu gen của mẫu bệnh phẩm c sự phù hợp với chủng HPV 16 trên thế giới:
So với HPV kiểu gen 16 chủng 16CN47 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-100%.
So với HPV kiểu gen 16 chủng 16CN46 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-100%.
So với HPV kiểu gen 16 chủng 16CN45 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-100%.
So với HPV kiểu gen 16 chủng 16CN44 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-100%.
So với HPV kiểu gen 16 chủng 16CN42 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-100%.
- Sự tương đồng trình tự nucleotide với của các chủng HPV phân lập ở mô bệnh nhân Polyp mũi xoang so sánh trên ngân hàng gen:
Hình 3.16. Hình ảnh đại diện cho kết quả minh họa peak của một đoạn trình tự ADN vùng LP1 của HPV11 ở bệnh nhân polyp mũi xoang Lý Thị H. (BA.
16.008006)
Kết quả so sánh trình tự chuỗi nucleotit của đoạn gen L1 phân lập từ bệnh phẩm trên ngân hàng gen sử dụng công cụ BLAST/Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/): kết quả giải trình tự đƣợc minh họa ở Hình 3.15.
Kết quả giải trình tự cho thấy peak rõ nét, đảm bảo cho việc định type HPV bằng phần mềm BLAST.
Bảng 3.12. Kết quả đối chiếu sự tƣơng đồng trình tự nucleotide với kiểu gen HPV11 của các chủng HPV phân lập ở mơ polyp mũi xoang
Tên loại Virus có kết quả tƣơng đồng Giá trị Số Độ tƣơng đồng lớn nhất Tổng độ tƣơng đồng Độ bao phủ Tƣơng đồng Human papillomavirus isolate H223 late protein L1 gene, partial cds
169 169 100% 99% KR674077.1
Human papillomavirus
isolate H079
nonfunctional late protein L1 gene, partial sequence
169 169 100% 99% KR674054.1 Human papillomavirus type 11 isolate F-213- HPV11 L1 capsid protein gene, partial cds 167 167 98% 99% KM501531.1 Human papillomavirus type 11 isolate Ir-RRP8 L1 protein (L1) gene, partial cds
167 167 98% 99% GU344782.1
Human papillomavirus type 11 isolate Ir-PC43 L1 protein (L1) gene, partial cds
167 167 98% 99% GU344763.1
Nh n xét:
Qua kết quả đối chiếu với ngân hàng gen trên đây cho thấy kiểu gen của mẫu bệnh phẩm số 7 c sự phù hợp với chủng HPV 11 trên thế giới.
So với HPV kiểu gen 11 chủng H223 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-99%.
So với HPV kiểu gen 11 chủng H079 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 97-99%.
tƣơng đồng từ 95-99%. So với HPV kiểu gen 11 chủng Ir-RRP8 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-99%. So với HPV kiểu gen 11 chủng Ir- PC43 của vùng gen L1 cho thấy sự tƣơng đồng từ 95-99%.
Bảng 3.13. Tỉ lệ phân bố kiểu gen HPV ở mô bệnh nhân UNĐNMX, UTMX và polyp mũi xoang phân tích bằng so sánh Genbank bằng cơng cụ BLAST/Search
Nh n xét:
Bằng phƣơng pháp so sánh Genbank dùng công cụ BLAST/Search tất cả các chủng HPV đƣợc giải trình tự gen cho thấy kiểu gen HPV 11 phổ biến trong các mẫu kiểm tra, trong đ u nhú đảo ngƣợc mũi xoang c 18/20 mẫu (90%), ung thƣ mũi xoang c 25/27 mẫu (92,6%) và polyp c 3/3 mẫu (100%). Chỉ c 2 trƣờng hợp (10%) u nhú đảo ngƣợc mũi xoang thấy kiểu gen HPV 6 và bệnh nhân ung thƣ mũi xoang c kiểu gen HPV 16 (7,4%).
3.2.2.2. Kết quả phân tích kiểu gen HPV bằng phương pháp phân tích nguồn gốc phát sinh lồi và dựng cây phân loài (Phylogenetic Analysis and Genetic Tree)
Bằng phƣơng pháp chuẩn trên thế giới về phân tích nguồn gốc phát sinh lồi là dựa trên trình tự gen tham chiếu các kiểu gen của HPV có sẵn trên ngân hàng gen (GenBank) so sánh với trình tự đoạn gen của các chủng HPV trong mẫu nghiên cứu của các nhóm, kết quả về kiểu gen hoặc dƣới kiểu gen (subgenotype) của chủng nghiên cứu thu đƣợc kết luận phải dựa trên khoảng
Nhóm Kết quả
UNĐN MX (1) UTMX (2) POLYP (3)
n % n % n %
HPV 6 2 10,0 0 0,0 0 0,0
HPV 11 18 90,0 25 92,6 3 100
HPV 16 0 0,0 2 7,4 0 0,0
cách di truyền của chúng so với chủng tham chiếu đã xác định đƣợc tính bằng cách sử dụng phƣơng pháp Kimura với hai tham số [61] và cây phát sinh loài đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbour-Joining [62]. Phân tích chúng tôi thu đƣợc kết quả của các nh m nhƣ sau:
- Nhóm u nhú đảo ngƣợc mũi xoang:
(B)
Hình 3.17. Kết quả phân tích kiểu gen HPV bằng phƣơng pháp phân tích nguồn gốc phát sinh lồi ở nh m UNĐN MX.
(A). Trình t nucleotide c a các ch ng HPV phân l p ở mô UNĐN MX c a bệnh nhân so với các ch ng HPV tham chiếu c a các ki u e ã ết trên ngân hàng gen hiệu chỉnh bằng ph n m m Bioedit; (B) Phân tích và d ng cây
phân loài bằ ơ á a Kimura và CS (2016). S ế ó
phân tích ằ ơ á Ne or-Joining [61] K oả á á r ây â o xá ị ớ ộ á = 2.80773265
[73] Cây â o eo ỷ ệ, ớ u á ro ơ ị ố oả á ế ó ử ụ ây á o K oả á ế ó o HPV oá ằ ơ
pháp Maximum Composite Likelihood [73] Cá m ếu â u e HPV á â ừ óm UNĐN MX ổ 34 rì u eo e P â ế ó ế ử ụ m m MEGA7 [63].
Phân tích trình tự nguồn gốc phát sinh loài của 20 chủng HPV ở mô bệnh nhân UNĐN MX cho thấy có 13 chủng (65%) thuộc kiểu gen HPV 31 (UN-1, 4, -8, -12, -23, -27, -38, -40, -50, -52, -53, -55, -57): 5 chủng (25%) thuộc kiểu gen HPV11 (UN-63, -58, -64, -80 và -81) và 2 chủng (10%) thuộc kiểu gen HPV6 (UN-61 và -68): khơng có chủng nào thuộc kiểu gen HPV16.
Kiểu gen HPV-31 chiếm ƣu thế ở bệnh nhân UNĐN mũi xoang, tiếp đến kiểu gen HPV11 và HPV6.
Có sự khác biệt rõ giữa kết quả phân tích kiểu gen bằng phƣơng pháp so sánh trình tự ngân hàng gene bằng công cụ Blast/Search (90% kiểu gen HPV11 và 10% kiểu gen HPV6) ở mô bệnh nhân UNĐN MX (Bảng 3.13) so với phƣơng pháp phân tích nguồn gốc phát sinh lồi kết hợp dựng cây phân loài (Phylogenetic Analysis and Genetic Tree) cho kết quả đúng với HPV11 chỉ 25%, HPV31 là 65%.
- Nhóm ung thư mũi xoang:
(B)
Hình 3.18. Kết quả phân tích kiểu gen HPV bằng phƣơng pháp phân tích nguồn gốc phát sinh loài ở nh m Ung thƣ mũi xoang.
(A). Trình t nucleotide c a các ch ng HPV phân l p ở mô u a bệnh nhân UTMX so với các ch ng HPV tham chiếu c a các ki u e ã ết trên ngân hàng gen sử dụng ph n m m Bioedit; (B) Phân tích và d ng cây phân lồi bằng ơ á a Kimura và CS (2016).
Phân tích trình tự nguồn gốc phát sinh lồi của 27 chủng HPV phân lập ở mô bệnh nhân ung thƣ mũi xoang cho thấy có 20 chủng thuộc kiểu gen HPV 11 (KMX-3, -12, -16, -18, -20, -22, -23, -28, -31, -33, -34, -35, -41, -43,